RAC试剂盒说明书1.doc

莱克多巴胺酶联免疫检测试剂盒使用说明 湖北同泰生物工程有限公司莱克多巴胺酶联免疫检测试剂盒使用说明一、 测量原理本试剂盒采用直接竞争酶联免疫吸附方法定量检测猪尿、猪肝、猪肉及饲料等样本中的莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)含量。在微孔板上预包被有偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应，样本/标准品中的游离莱克多巴胺与微孔板上预包被的偶联抗原竞争结合酶标记的莱克多巴胺单抗，显色后的测定结果呈现出样品吸光值与样品中的莱克多巴胺含量成反比的现象，利用样品吸光值与标准曲线进行比对即可得到样品中莱克多巴胺的含量。二、 试剂盒组成每一个盒中的试剂足够进行96个测量(包括标准分析孔)，盒中的材料如下：a) 包被好的96孔酶标板1块(12条8孔)：预包被偶联抗原，无需洗涤b) RAC标准液7瓶(4mL)：浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0ng/mLc) 酶标物浓缩液1瓶(0.8mL)：红色溶液，使用时用酶标抗体稀释液1:9稀释d) 酶标物稀释液（8ml）：用来稀释酶标物浓缩液e) 浓缩提取液（8ml）：提取样品用，使用时1:9稀释f) PBS稀释液1瓶(30mL)：样品稀释液g) PBST浓缩液1瓶(50mL)：洗板用，使用时1:19稀释h) 显色液A液1瓶(6mL)i) 显色液B液1瓶(6mL)j) 反应终止液1瓶(6mL)：1M硫酸三、 检测所需设备和试剂所需设备：酶标仪(450nm)，恒温箱，氮吹仪，混合振荡器，超声波清洗仪，微量移液器(20-200微升，100-1000微升，1-10微升)，多道移液器(50-300微升)所需试剂：乙腈、正己烷、乙酸乙酯四、 样品处理1. 尿样取1.0mL尿样，加入1mL提取液混匀，再加入3mL乙酸乙酯，充分振荡10min；5000rpm室温离心10min；取1.5mL上清液60度氮气吹干；加入0.5mL PBS稀释液(样品稀释液)，混匀，取50L液体待测。最终检测结果乘以稀释倍数12. 组织样品（肌肉、肝脏）2.0g均质样品（肌肉、肝脏）加入6mL乙腈，剧烈振荡10min，然后5000 rpm室温下离心10min取1mL上层清液于60氮气流中吹干残留物加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动30秒再加入1mL PBS稀释液(样品稀释液)混合，振荡混匀1min，然后5000 rpm室温离心10min取下层液50l用于检测最终检测结果乘以稀释倍数43. 饲料样品用研体研碎饲料样品，取1.0g加入3mL提取液混匀，再加6mL乙酸乙酯，充分振荡10min；5000rpm室温离心10min；取1.0mL上清液60度氮气吹干；加入1.0mL正己烷，振荡30秒，混匀，再加入1.0mLPBS稀释液(样品稀释液)，混匀；5000rpm室温离心10min；取下层清液50L用于检测；最终检测结果乘以稀释倍数6五、 分析步骤1. 试剂准备 检测之前将试剂盒组分取出室温平衡至少30分钟； 提取液：提供的提取液为浓缩液，使用前按10倍稀释（如：5mL浓缩提取液加45mL蒸馏水） PBST溶液：提供的PBST溶液为浓缩液。使用前按20倍稀释(如：25mLPBST浓缩液加蒸馏水稀释至500mL)。 酶标物：提供的酶标物（酶标抗体）为浓缩液。每次使用时只稀释实际需用量的酶标记物。酶标物按10倍稀释(如：100L酶标物加0.9mL 酶标物稀释液)。在吸取浓缩液之前，要仔细地振摇，剩余的仍放置2-8保存。 微孔板条：取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板用胶带封好，放进原袋中重新密封，2-8保存, 注意板孔切忌受潮保存。 注意每种液体试剂使用前需摇匀，PBST浓缩液可能会在低温下有晶体析出，如遇此种情况，则需稍稍加热将晶体溶解后再行使用。2. 测定程序 取出所需数量的微孔板及框架，于室温下平衡一段时间。 将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准点均需作2孔平行。 加入50L的标准液或处理好的样品到其余各自的微孔中。 加入50L稀释好的酶标物（酶标抗体）到各微孔中，小心地使酶标板在平面上做圆周运动以充分混合，23-28(推荐使用25恒温箱)避光孵育30分钟。 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体，用300L PBST溶液充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作四次。 加入显色液A、B液各50L到各微孔中，小心地使酶标板在平面上做圆周运动以充分混合并在23-28(推荐使用25恒温箱)暗处避光孵育20分钟。 加入50L反应终止液到微孔中，摇板混匀后在450nm 处测量吸光度值。3. 注意事项 反应终止液为1M硫酸，切勿接触皮肤。全部生物材料均应避免接触皮肤和粘膜 准确吸取试剂和充分洗涤对结果的准确尤其重要 所用试剂在使用前必须先恢复到室温(23-28) 孵育及显色温度不能低于23，推荐使用25恒温箱，有利于测量结果的稳定 微孔板拆封后避免受潮或沾水，不要接触微孔底部，以免弄脏，影响测量结果 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射微孔板 试剂使用完毕，务必放入试剂盒中，保存2-8冰箱 不能使用失效后的试剂盒成分，也不能混用不同批次的成分 本试剂盒有效期为2-8冰箱保存12个月 加入显色液A、B液后于室温下暗处避光孵育20分钟，如果室温温度较高，建议将时间缩短至15分钟，最短不低于10分钟；如果室温较低，建议将时间延长至25分钟，最长不超过30分钟，以上孵育时间可根据显色深浅自行调节。六、 测量结果从含有标准液或样品的板孔的各吸光度值（OD）中，作为测量OD值。所获得的标准和样品的测量OD值（重复孔为平均值）除以第一个标准(0标准)的吸光度值再乘以100%，因此0标准等于100%并且以百分比的形式给出吸光度值。计算的标准值绘成为一个对应RAC浓度(ng/g,或ng/mL)的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在0.1-4ng/g(ppb)范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度