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饲喂羊栖菜多糖（SFPS）对小鼠免疫功能及小肠绒毛形态的影响陆佳斌 王才 张辉辉 林洁 李彩燕 王伟摘要本文以羊栖菜多糖为材料、纯种ICR品系小鼠为实验动物，研究了不同浓度的羊栖菜多糖（100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg）以及羊栖菜多糖+免疫制剂对纯种ICR品系小鼠空肠绒毛的结构形态、血清睾酮、雌二醇和孕酮3种激素含量、上皮内淋巴细胞以及杯状细胞分布数量的影响。结果发现，羊栖菜多糖对血清内激素含量的无明显影响，对上皮内免疫细胞数和肠道形态影响较为明显。日粮中添加羊栖菜多糖可以提高小鼠空肠绒毛长度和隐窝深度的比值（V/C），同时增加肠道上皮细胞内淋巴细胞数量和杯状细胞数量，从统计数据可以看出日粮200mg/kg羊栖菜多糖制剂的添加效果较好。关键词羊栖菜多糖；空肠绒毛形态；免疫细胞AbstractSFPS pure-bred ICR strain mice were used as experimental animals, different concentrations SFPS (SFP1-100mg/kg, SFP2-200mg/kg, SFP3-300mg/kg) of SFPS + immune preparation of pure-bred ICR strain mice jejunum villus morphology, serum testosterone, estradiol and progesterone hormone content of intraepithelial lymphocytes and goblet cell distribution of the number of impact. It was found that SFPS had no significant effect on serum hormone levels, the number of immune cells and intestinal epithelial morphology influence is more obvious. SFPS diets can improve the mouse jejunum villi length and crypt depth ratio (V/C), at the same time increase the number of lymphocytes in intestinal epithelial cells and the number of goblet cells, from statistical data can be seen add effects of grain 200mg/kg SFPS preparations.Key words SFPS; intestinal villus morphology; immune cells前言羊栖菜（Sargassum fusiforme（Harv.）Setch）为马尾藻科马尾藻属植物1，为多年生大型海藻，在我国沿海均有生长。羊栖菜作为一种经济海藻，具有多种药理活性的酸性多糖，主要由褐藻酸及褐藻糖胶组成 2 ，不但具有丰富的营养价值，而且还具有显著的医学功用。目前证实，羊栖菜富含多糖、蛋白和多种对人体有益的微量元素，尤其是羊栖菜多糖的抗肿瘤作用，还有增强免疫，清除荷瘤小鼠体内自由基、抗脂质过氧化，降血脂、降血糖和促进机体生长发育等多种药理活性3 4，SFPS在医药保健食品方面具有广泛的开发及应用价值。1 材料与方法1.1实验动物处理试验用8周纯种ICR品系小鼠72只购自宁波大学实验动物中心，体重203g左右，雌雄各半。饲养室温232C，湿度5060%，光照强度150200Lx，12h明暗交替，噪音50dB，给予充足的饲料和水，自由采食，预饲两周后进行羊栖菜多糖（SFPS）饲喂实验。实验分为6组，其中3个组单独饲喂不同浓度的SFPS，1个免疫抑制组，1个免疫抑制+SFPS组，1个对照组。每组12只，雌雄各半分笼饲养。单独饲喂SFPS3个组，每只每天饲喂量分别为低浓度组2mg（S1组）、中浓度组4mg（S2组）和高浓度组8mg（S3组），通过灌胃给药；1个免疫抑制组（SY组），通过腹腔注射环磷酰胺的方式建立，每只注射剂量为3mg，于实验开始第一天注射；1个免疫抑制+SFPS组（CY+S组），在免疫抑制组的基础上每只每天灌胃饲喂4mg SFPS；1个对照组（C组），每日每天灌胃饲喂等量的生理盐水。小鼠灌胃的体积为0.2mL，SFP用生理盐水溶解，灌胃的时间为每日上午8:30，连续14天，对小鼠实验结束时体重进行称量。小鼠屠宰后对血浆样品和肝脏样品进行液氮速冻后在-80保存，分别对脾脏和胸腺进行称量，取两段0.5cm左右的空肠组织浸泡于4%多聚甲醛中，固定时间24h。1.2 试剂和仪器环磷酰胺由江西山高制药公司生产，羊栖菜多糖由浙江省温州洞头县汇源海生物开发有限公司生产，小鼠丙氨酸转氨酶/谷丙转氨酶（ALT/GPT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）测定试剂盒由南京建成科技有限公司生产，雌二醇、孕酮和睾酮放射免疫分析试剂盒由北京北方生物技术研究所生产。Nikon 80i生物纤维成像系统用于组织学图像的拍摄和分析，美谱达公司V-1800型可见分光光度计用于ALT/GPT、MDA、SOD和GSH测定，TCX1-FMQ9013C型号放射免疫分析仪用于激素测定。1.3 免疫器官指数屠宰后立即解剖并分离脾脏和胸腺，称重并计算免疫器官指数。免疫器官指数的计算公式：免疫器官指数（mg/g）=免疫器官重量/活体重。1.4 肝功能指标测定低温保存的肝脏组织低温匀浆后用于ALT/GPT、MDA、SOD、GSH测定，方法详见相应说明书。1.5 空肠组织学切片观察肠道样品固定好后进行常规石蜡切片组织学处理，制成7m厚切片，HE染色后进行观察和拍照。利用生物彩色显微图像分析系统对空肠形态结构进行测量（放大100倍），对肠绒毛上皮淋巴细胞和杯状细胞的数量进行统计（放大400倍）。其中每个个体取6个纵截面进行分析，每个截面随机均匀取10个点对肠绒毛高度、隐窝深度、肠壁厚度、粘膜层厚度、内环肌和外纵肌厚度进行测量并取平均值。计算肠绒毛长度与隐窝深度的比值（Villi Height/Crypt Depth，V/C比值）。肠绒毛上皮淋巴细胞和杯状细胞的数量统计时，每个截面选取5根最长且排列整齐的绒毛，统计其数量的百分比值。1.7 统计分析试验数据采用SPSS数据处理软件进行方差分析和显著性检验，数据以平均数标准差表示，各平均数之间用Duncan法进行多重比较。全文中以不同组间P0.05）。其中免疫抑制组（CY）胸腺指数和脾脏指数显著低于正常组（C）和饲喂SFPS组（S1、S2和S3）（p0.05）。然而，免疫抑制组（CY）中ALT/GPT和MDA显著高于对照组（C）和SFPS组（S1、S2和S3），SOD和GSH显著低于对照组（C）和SFPS组（S1、S2和S3）。免疫抑制组在饲喂SFPS后（CY+S组），ALT/GPT和MDA指标在实验结束时能恢复到正常水平，而SOD和GSH虽有显著升高，但是未能恢复到正常水平。图2 饲喂SFPS对小鼠肝脏功能的影响2.2饲喂SFPS对小鼠形态结构的影响与正常对照组的小肠绒毛相比（图3A），饲喂SFPS后S1组肠绒毛的长度明显变长（图3B），但是S2和S3组肠绒毛长度变得粗短（图3C，3D）。CY组绒毛长度明显比对照组要短，但是饲喂SFPS后，肠绒毛的长度和密度都有增加。图3 饲喂SFPS对小肠绒毛结构的影响（放大100倍）通过测量不同组之间空肠绒毛长度和隐窝深度，并得到V/C比值，结果如图4所示。S1组绒毛长度显著高于对照组和其它各实验组（P0.05），但是随着SFPS饲喂量的增加，绒毛长度反而出现了下降的趋势CY组绒毛长度显著低于对照组、S1组和S2组，免疫抑制后肠绒毛高度能恢复到正常水平(图4A)。各实验组隐窝深度显著低于对照组（P0.05）(图4C)。图4 饲喂SFPS对小鼠绒毛长和隐窝深的影响饲喂SFPS后肠壁厚度测量统计结果如图5所示，随着SFPS添加量的增加，肠壁厚度有下降的趋势，但是差异并不明显(p0.05)。与实验组和饲喂SFPS组相比，CY组中肠壁厚度显著降低(p0.05)，而在CY+S组肠壁厚度有升高的趋势，但是差异并不明显，没有达到对照组的水平（图5A）。肠壁内环肌的厚度随着SFPS饲喂量的增加也出现了下降的情况，其中S1组和对照组差别不明显，而S2和S3组的内环肌厚度则发生了显著的降低(p0.05)。与实验组和饲喂SFPS组相比，CY组肠道内环肌厚度均显著降低(p0.05)，而在CY+S组发生显著升高(p0.05)，但是依然低于对照组水平(p0.05)（图5B）。图5 饲喂SFPS对小鼠肠壁厚和内环肌厚的影响2.3饲喂SFPS对小鼠肠道内免疫相关细胞的影响小鼠肠道组织经HE染色后，在显微镜高倍镜下统计与免疫相关的上皮淋巴细胞和杯状细胞，结果如图6所示。饲喂SFPS后S1组和S2组上皮淋巴细胞核杯状细胞的数量发生的显著的升高(p0.05)，而杯状细胞则发生了显著的升高(p0.05)。CY组上皮淋巴细胞和杯状细胞均发生了显著降低(p0.05)，但是CY+S组均能恢复到对照组水平。图6 饲喂SFPS对肠绒毛上皮免疫细胞的影响3 讨论3.1 饲喂SFPS对小鼠免疫功能的影响通过测定免疫器官指数，发现饲喂SFPS后小鼠胸腺指数和脾脏指数有升高的趋势，但是差异并不显著。但是对于免疫抑制组来说，SFPS能显著提高小鼠的免疫器官指数，并恢复到正常的水平。因此，SFPS对环磷酰胺造成的免疫损伤具有一定的拮抗作用，能提高小鼠机体的免疫能力。通过对肝脏内ALT/GPT、MDA、SOD、GSH抗氧化指标的测定，结果发现饲喂SFPS并不能显著提高小鼠机体抗氧化能力。但是但是对于免疫抑制的小鼠来说，SFPS既能能显著降低ALT/GPT和MDA的水平并使其恢复正常，又能显著提高SOD、GSH的水平，虽然与正常组相比差异依然显著。3.2 饲喂SFPS对小鼠小肠绒毛形态的影响饲喂SFPS后，小鼠小肠绒毛的长度并没有随着饲喂量的增加而增加。低浓度S1组绒毛长度显著高于对照组，而中浓度S2组和高浓度S3组绒毛长度并没有持续增加，而是恢复到正常的水平。这可能是由于SFPS浓度太高对肠绒毛起到了相反的作用。饲喂SFPS显著降低了隐窝深度并显著提高了V/C比值，从这点来看SFPS确实能显著改善小鼠肠道的吸收功能。而对于免疫抑制组来说，小肠绒毛和隐窝深度均发生了显著降低，以至于V/C比值和正常组相差不显著，但是这并不能表明免疫抑制组肠道功能的正常。饲喂中浓度和高浓度SFPS也显著降低了肠道内环肌的厚度，但是肠壁厚度的影响并不显著。而对于免疫抑制组来时，肠壁厚度和内环肌厚度均发生了显著的降低，而在饲喂SFPS后又能恢复到正常的水平。3.3 饲喂SFPS对于小肠上皮免疫细胞的影响整体上来说，饲喂SFPS能显著提高小肠上皮淋巴细胞和杯状细胞的含量，对于提高小鼠免疫功能具有积极的影响。对于免疫抑制组来说，小肠上皮淋巴细胞和杯状细胞的含量显著低于对照组，但是饲喂SFPS后其水平能恢复到对照组水平。空肠形态学变化肠道是机体消化与营养物质吸收的重要场所，肠绒毛作为小肠的重要组成部分不但在营养物质吸收上至关重要，而且其强有力的、有规律的摆动有利于排斥有害菌群的定植。同时，小肠绒毛形态的变化也会直接影响绒毛的总表面积，从而影响机体对吸养物质的收营能力6。Caspary等7报道指出肠绒毛长度增长后会使小肠接触营养物质的面积增大，从而增强小肠对营养物质的吸收功能，所以肠绒毛的形态直接和机体的生长发育有关。隐窝深度则是反映了隐窝细胞的增殖率和成熟度，即细胞生成率。隐窝细胞从底部向绒毛上部迁移、分化，在迁移过程中细胞逐渐分化并形成具有吸收能力的柱状细胞，形成具有吸收能力的绒毛细胞，以补充绒毛上皮的正常脱落。如果此过程减慢，则基部的细胞生成率降低，使隐窝变浅。肠绒毛高度与细胞数量呈显著相关，绒毛较短时成熟的绒毛细胞减少且对养分的吸收能力低。3.2黏膜形态及黏膜免疫系统肠黏膜层结构特点是有环形皱襞、肠绒毛和小肠腺，肠黏膜是肠道屏障的重要组成部分，它主要包括黏膜上皮、上皮之间的连接结构、上皮的基膜、细胞表面的细胞衣。黏膜层与肠道上皮细胞相互作用、相互影响，保护肠道免受细菌、病毒等微生物的黏附和入侵及防止异物的吸收，起到机体第一道防线的作用。而肠道屏障作用主要由IEL和GC等免疫细胞和细胞因子来完成8,9。黏膜免疫系统作为机体相对独立的免疫系统，是由大量独特的免疫分子和独特的细胞群构成的。根据分布的位置不同，黏膜免疫细胞可分为诱导免疫细胞和效应免疫细胞，即诱导部位的免疫细胞和效应部位的免疫细胞。诱导部位是黏膜接触并摄取抗原和最初反应的部位，效应部位是发生免疫反应的部位，前者主要是指肠上皮细胞、微皱褶细胞和专职抗原呈递细胞(专职APC)，后者包括上皮内淋巴细胞(IEL)和固有层淋巴细胞(LPL)10。本实验中只要观察和统计上皮淋巴细胞和杯状细胞。3.3其他上皮免疫细胞肠上皮内淋巴细胞作为一种特殊的淋巴细胞群体，其长期与倡导菌群、病原体等接触，在粘膜抗感染免疫、调节上皮细胞完整性和调节外来抗原的免疫应答方面骑着重要作用11。肠道相关淋巴组织分为组织性淋巴样组织及散在整个肠壁中的淋巴细胞。上皮内淋巴细胞是粘膜免疫中最先接触抗原的免疫活性细胞，在倡导黏膜中起重要的免疫屏障作用12。因此，小肠上皮内淋巴细胞的数量可以反映小肠局部粘膜免疫屏障的完整及免疫防御功能的完整程度13。黏膜诱导部位包括集合淋巴结和腹腔淋巴结。诱导免疫细胞主要是指肠上皮细胞、M细胞和专职抗原呈递细胞(专职APC)。根据和细胞的分布特点将结分为三个区：滤泡区以细胞为主；上皮下圆顶区既有细胞又有细胞，且细胞也位于此区；滤泡间区以细胞为主14。4结论 本实验结果表明，日粮中添加羊栖菜多糖可以提高小鼠绒毛长度和隐窝深度，同时增加肠道上皮细胞内淋巴细胞数量和杯状细胞数量，而对血清种激素的含量无明显的影响。从总体的统计数据可以得出结论，日粮200mg/kg羊栖菜多糖制剂的添加效果较好，其次是300mg/kg羊栖菜多糖制剂组。参考文献1 Shibata H,Kimura-Takagi I,Nagaoka M,et al.Properties of fucoidan from cladosiphon okamuranus tokidain gastric mucosal protection J.Bio factors,2000,11(4):235.2 Thomas A,Harding KG,Moore K. 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