拟南芥热激蛋白的 Westren Blotting试验设计书.doc

拟南芥At-HsfA1a过量表达转基因植株与非转基因植株的At-HsfA1a和HSP70表达量分析(1) 转基因和非转基因植株的生长：将转基因和非转基因的种子消毒后（无菌水浸泡半小时；1%升汞3min； 70%乙醇1min；无菌水洗三次。）分别播种于含PPT（10mg/l）和不含PPT 的1/2 MS盐培养基中。15天后，将小苗移入土中进行栽培。(2) 小苗逆境处理（取生长状态较为健康的叶片13张，约80-100mg左右）：加热处理：将叶片置于SIB缓冲液中，39，30min酸处理：将叶片置于用琥珀酸调的pH值最终为3.5的SIB中，20min碱处理：将叶片置于用Tris碱调过的pH最终为8.0的SIB中，20min过氧化氢处理：将叶片置于5mM的过氧化氢中，45min以上处理除加热外其余均在抽真空的情况下进行(3) 叶片总蛋白提取：吸去逆境处理液，同时加入PBS buffer清洗；用滤纸吸干叶片（0. 1g）表面缓冲液，加入液氮研磨；加入50ul lysis buffer +0.5ul DTT（使用的是凯基Caspase-3分光光度法检测试剂盒中配套的蛋白质提取缓冲液lysis buffer 和DTT缓冲液），冰上裂解2060min，期间振荡34次，每次10秒；4 10000rpm,1min,离心两次，去掉沉淀，取上清。(4) 蛋白质浓度测定：取5ul crude extract（粗提物）+ 95 bradford, OD595下测定光吸收值，根据标准曲线测定蛋白质粗提物的浓度。考马斯亮兰法具体操作步骤:（一）实验原理1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂25分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。 (5) 加入等体积2XSDS loading buffer, 沸水煮10min。根据蛋白质浓度的不同，取不同体积的量上样，以使蛋白上样量一致，控制蛋白质的上样总量为12ug左右。(6) SDS-PAGE 电泳检测使用浓缩胶2.7%; 分离胶7.5的聚丙烯凝胶进行电泳；上样时，使用的蛋白质Marker为Marker为High Molecular Weight Calibration Kit for Electrophoresis；跑胶时，使用恒流20mA, 室温下1.5小时即可。其他操作均与一般的SDS-PAGE电泳的一致。 胶的制备利用BIO-RAD的蛋白电泳装置，灌制厚度为1.5mm、浓度为10%的分离胶3.5ml，及5的浓缩胶，待浓缩胶聚合后，轻轻地拔出梳子立即用电极缓冲液冲洗上样孔，组装电泳仪，加入电极缓冲液。 样品的制备10l样品+10l 的2上样缓冲液(100mM Tris pH 6.8，4% SDS, 20% 甘油，10% 巯基乙醇，0.02% 溴酚兰)混匀后煮沸10 min，短暂离心后即可上样。 电泳连接电源，先以恒压80v电泳至溴酚兰染料从浓缩胶进入分离胶时，将电压调至120v至溴酚兰达到胶的底部。关掉电源，停止电泳。 剥胶、染色和脱色弃去电泳缓冲液，用专用工具轻轻将玻璃板撬开，切除凝胶的一角作为标记用去离子水冲洗凝胶，并轻轻将凝胶剥离出来，移至大培养皿中。加入30-35毫升考马斯亮蓝染色液，在脱色摇床上染色约2 h后，弃染色液，用冲洗后加入适量脱色液进行脱色，直到显出清晰的蓝色条带和干净的背景。注意在操作中尽量不能用手接触凝胶。(7)对At-HsfA1a, y-Hsf进行电印迹转膜及western 分析 水浴式电印迹剪取和凝胶同样大小的PVDF膜一张及Watman 3MM滤纸四张，在100%甲醇溶液中浸没23s，再转移到电印迹缓冲液中，浸没15min。同样将电泳后的SDS聚丙烯酰胺凝胶（不染色）转移到电印迹缓冲液中，浸没12min。打开转移槽的胶板并依次放入：电印迹缓冲液浸湿的海绵；与凝胶等大的电印迹缓冲液浸湿后的Watman 3MM滤纸；SDS聚丙烯酰胺凝胶；PVDF膜；与凝胶等大的电印迹缓冲液浸湿后的Watman 3MM滤纸；电印迹缓冲液浸湿后的海棉。即做成转移印迹夹心饼（transblotting sandwich），注意在做每一层时都要用玻璃棒抹去所有的气泡。小心合上转移槽的胶板，向槽内倒入电印迹缓冲液，浸没转移胶板。以50v恒压进行电印迹转膜，室温下4h。注意凝胶的一侧接电源负极，PVDF膜的一侧接电源正极。60mA，2.5h，冰浴搅拌下使其尽量保持低温同时温度均匀。 封闭(以后所有操作均在室温下进行)：用3BSA的blocking buffer摇床上封闭30min。转膜后，膜上其它没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封闭，以避免非特异性结合。这是由于Western Blotting的灵敏度，特异性在很大程度取决于封闭的好坏。过度的封闭导致抗原表位的遮蔽，从而降低检测灵敏度。不完全封闭又会导致最终背景增高或信噪比太低。最常用的封闭液是脱脂奶粉，由于脱脂奶粉的成分比较复杂，里面微量的生物素或碱性磷酸酶就可能造成背景的污染而不太适合生物素亲和素检测和碱性磷酸酶底物检测系统。另外，脱脂奶粉里的其它微量蛋白质有可能和待检测抗原有相似的抗体识别表位而造成交叉反应。 加一抗：自制抗血清可按1:500或1:1000的比例加入，然后在1.5BSA的half-blocking buffer 中，摇床上共培养1h。之后洗去一抗：用washing buffer 洗膜3次，每次摇床5min。 加二抗：分别加入goat anti-rabbit Ig G(alkaline phosphatase conjugate) 2ul于5ml 的1.5BSA 的half-blocking buffer 中，摇床上共培养2h。之后洗去二抗：用washing buffer 洗膜5次，每次摇床上5min. 使用NBT/BCIP 显色试剂盒摇床避光条件下显色，约5-20min后，待印迹出现且背景不太浓时终止显色，用水洗去显色液，用滤纸吸干。碱性磷酸酶 经免疫反应固定的碱性磷酸酶可催化底物5-溴-4-氯-3-吲跺磷酸氮蓝四唑（BCIPNBT）在原位转变为深蓝色化合物。1）配制下列3种溶液：NBT 在10 ml 70的二甲基甲酰胺中溶解0.5g NBT。BCIP 在10 ml 100的二甲基甲酰胺中溶解0.5BCIP。碱性磷酸酶缓冲液100 mmol/L NaCl5 mmol/L MgCl2100 mmol/L Tris-Cl （pH9.5）放在密闭容器中保存于室温，这一溶液是稳定的。2）取