不同浓度盐环境对副溶血性弧菌生长的影响.doc

本科生毕业论文(设计)题 目:不同浓度盐环境对副溶血弧菌生长的影响 姓 名: 周鹏飞 学 院: 动物科学学院 专 业: 动物医学 班 级: 2008级（1）班 学 号: 1222080139 指导教师: 胡元庆 职称: 讲师 2012 年 6 月2 日安徽科技学院教务处制 目 录摘要.1关键词.1引言.11材料与方法.21.1 材料.2 1.1.1菌株来源.2 1.1.2培养基.2 1.1.3试剂.2 1.1.4仪器.21.2方法.2 1.2.1 培养基制备.2 1.2.2 菌株增殖.3 1.2.3 配置不同盐浓度的肉汤培养基.3 1.2.4 菌株接种培养基.3 1.2.5 菌体浓度的测定.32结果.32.1不同盐类肉汤培养基对菌株RIMD的生长的影响.32.2不同盐浓度肉汤培养基对菌株RIMD的生长的影响 .52.3不同盐类肉汤培养基对菌株VP12的生长的影响 .62.4不同盐浓度肉汤培养基对菌株VP12的生长的影响 .73讨论.84小结.9致谢.9参考文献.9英文摘要.11 不同浓度盐环境对副溶血弧菌生长的影响 2008级动物医学1班 周鹏飞指导老师：胡元庆（讲师)摘要：目的 观察不同浓度盐环境对副溶血弧菌生长的影响。方法 通过测量副溶血弧菌在五种常见盐类（氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙及磷酸二氢钠），不同浓度（12%、6%、3%、1.5%、0.375%）和不同时间段（6h、24h）培养后的OD600值，分析细菌在不同盐浓度的生长情况。结果 不同盐类生长情况：副溶血弧菌在五种盐类均能生长，其中以NaCl的肉汤培养基生长最为良好，KCl、MgCl2次之，CaCl2、Na2HPO4较差；不同盐浓度的生长情况：盐浓度为3%是生长最为良好，6%、1.5%生长次之，超过12%或低于0.375%时，生长受到抑制。结论 副溶血弧菌系嗜盐性细菌，其在高盐高渗环境下可生长，在生理浓度盐浓度中生长较差。关键词：副溶血性弧菌；细菌增殖；盐浓度；OD600值副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus ,Vp）是一种广泛分布于海洋与盐湖环境中的嗜盐性细菌,海产品中常有此菌1-2，食用了被副溶血性弧菌污染的海产品，可能引起食物中毒，主要引起急性胃肠炎，致病性强，其发病急，传播快，感染源多，在人群中流行的持续时间长，属国际上要求检疫的传染病之一，对人类的健康造成极大的威胁。此外, 食用了被该菌污染的腌菜也能引起食物中毒。近年来, 由于海产品倍受广大消费者青睐, 由该菌引起的食物中毒时有发生3-5 。同时由于此类细菌并不太为人们所重视，对其的了解并不是特别充分。因此，通过研究副溶血弧菌可使更多的人们了解、掌握此类细菌所引起的疾病，从而能够更好的避免，对人们健康做出贡献。副溶血弧菌第一次被认为是一种食源病原是在1950年日本大阪，引起272人发病，20人死亡，与食用沙丁鱼有关6。副溶血弧菌引起的肠炎第一次在美国暴发是在1972年，马里兰洲出现425例肠炎患者7。从1973年1998年，USCDC报道在美国的沿海地区由于食用生贝和海鲜引起40次副溶血弧菌的感染。2004年夏季，阿拉斯加有14人因食用生牡蛎而患肠炎。2006年夏季，在华盛顿与哥伦比亚，由于食用副溶血弧菌污染的牡蛎引起177人患病8。这些疾病暴发的几率说明食用致病性副溶血弧菌污染的牡蛎是引发疾病的原因。我国最早报道副溶血弧菌食物中毒是在1962年，由张孝秩等人在中华医学杂志报道上海市传染病医院从19591961年收治副溶血弧菌食物中毒患者240人，并分离出副溶血弧菌。在中国大陆地区，根据国家食源性疾病监测网对我国13个省食源性疾病暴发情况的监测数据，自19922001年的十年间共上报食物中毒事件5770起，患者人数达162995人，其中由微生物引起的食源性疾病事件和涉及人数最多，分别占总体的38.5%和50.9%，在细菌性食物中毒的构成中，又以副溶血弧菌引起的急性肠胃炎占首位9。分析研究我国1959-2004年副溶血弧菌食物中毒流行病学特征，发现副溶血弧菌食物中毒在我国地区分布已经发生改变，不仅沿渤海、黄海、东海、南海，沿长江也有分布10。 副溶血弧菌隶属于弧菌科中的弧菌属，常存在于近海水、海产品及盐渍食品中, 是我国沿海地区夏季、秋季食物中毒和急性腹泻的主要病原菌。该菌在海水中可存活47d, 淡水中可生存12d, 夏季海产品的平均带菌率高达94. 8%11。所以，应进一步加强这方面卫生知识的宣传与普及，引导居民在食用此类食物时一定要煮熟蒸透，以确保杀死病原微生物12。特别是在人员相对集中的工地和学校，要在主要位置开辟预防食物中毒的专栏，让更多的人加深对副溶血弧菌等病菌的认识。因此, 通过观察副溶血弧菌在不同盐浓度下的生长情况，从而了解掌握其生活习性，具有重要的实际意义和较高的科研价值。1材料与方法1.1材料1.1.1 菌株来源 副溶血弧菌两种菌株 （VP12、RIMD）安徽科技学院动物医学实验室提供1.1.2 培养基 普通肉汤培养基:由牛肉膏5g,蛋白胨10g,磷酸氢二钾 1g 水1000mL混合组成。配制：将水加热,加入牛肉膏、蛋白胨溶解后，以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整酸碱度调至PH值7.47.6。分装,高压灭菌121, 15min。1.1.3试剂 氯化钠、牛肉膏、琼脂、蛋白胨、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸二氢钾等1.1.4仪器 GSP-9050MBE隔水式恒温培养箱,上海博迅实业有限公司医疗设备厂；GNP-9270BS-III隔水式恒温培养箱,上海新苗医疗器械制造有限公司；净化工作台，上海三发科学仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂；电子分析天平,梅特勒- 托利仪器上海有限公司；7230G可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;电磁炉，江苏苏泊尔电器有限公司；试管，平皿等。1.2方法1.2.1 培养基的制备 1.2.1 .1无NaCl的普通肉汤培养基 牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，磷酸氢二钾1 g，蒸馏水1000 ml，在搪瓷缸内将以上成分混合，加热溶解后倒入锥形瓶内，以0.1 mol/L氢氧化钠溶液调整酸碱度至pH 7.4-7.6，使用滤纸过滤后，塞上棉塞。1.2.1.2 普通琼脂培养基 普通肉汤500 ml，琼脂10 g, 将琼脂加入到3%NaCl肉汤培养基中，加热煮沸20min，待琼脂完全融化后，将酸碱度调至pH 7.4-7.6，再加热煮沸20 min，并补充蒸发的水分，用蒸馏水湿润夹有薄层脱脂棉的纱布过滤，边过滤边分装培养皿，每个培养皿3-4 mm厚。盖上培养皿，121 高压灭菌15 min备用。1.2.2 菌株增殖 用灭菌后棉签将试管斜面培养基中细菌挑出，再将其接种3%NaCl肉汤培养基中，置于37恒温培养箱中培养24h，每个菌株接种五个平皿培养基，两菌株共接种10个。1.2.3 配制不同盐浓度的肉汤培养基 将上述的无NaCl的普通肉汤培养基，用量筒量取100mL于搪瓷缸中，再用电子分析天平称取12g分析纯NaCl，倒于其中，电磁炉加热溶解后，再将其倒入烧杯中，此即为12%NaCl的肉汤培养基。分装试管，每管5mL，塞上棉塞，用包装纸扎好待灭菌，为保证试验效果故每个菌株重复三次，共分装6个试管。依倍比稀释法再分别配制6%、3%、1.5%、0.375% NaCl的肉汤。同样可分别配制浓度为12%、6%、3%、1.5%、0.375%的氯化钾、氯化镁、氯化钙及磷酸二氢钠的肉汤培养基。1.2.4 菌株接种培养基 在无菌操作台用灭菌后的接种环挑取增殖后的单菌落细菌，将菌种于上述的不同盐浓度、不同盐类的肉汤培养基内，再置于37恒温箱内培养6h、24h后，测定OD600值。1.2.5 菌体浓度的测定 分别于培养后6h和24h，使用可见分光光度计测量，以蒸馏水作为参比，于波长600nm处，用1cm比色皿测定菌液的OD600值，重复三次，取平均值。2 结果2.1 不同盐类肉汤培养基对菌株RIMD的生长的影响 接种副溶血弧菌RIMD菌株于不同盐类的肉汤培养基中，37恒温培养6h、24h后，分别测定其OD600值，后用Excel制成柱状图，见图1、2图1 副溶血弧菌RIMD株在不同盐类肉汤培养基培养6h后的OD600值图2 副溶血弧菌RIMD株在不同盐类肉汤培养基培养24h后的OD600值 由图1和图2可知，菌株RIMD在CaCl2肉汤培养基中培养一段时间后，相对于其他四组盐类培养基，所得OD600值较大，特别是在盐浓度为12%时，数值明显偏大，达到1.4以上，远远高于同浓度下其它盐类培养基OD600值，在实验过程中，浓度较高的CaCl2肉汤中会出现一层白色絮状沉淀，故可知在CaCl2肉汤培养基下所得的OD600值与细菌浓度关系不大；细菌在Na2HPO4 肉汤培养基中生长最缓，数值与其他四组相差较大，细菌生长状况不佳；从NaCl肉汤培养基中所得数据可较明显看出，3%左右为其最适浓度，菌株生长正常，在超过12%时，菌体生长受抑制；KCl情况与NaCl相似，只是最适浓度范围扩大，在盐度为1.5%-6%时，菌株RIMD可良好生长；MgCl2肉汤培养基内的生长情况与CaCl2相似，细菌在不超过3%的较低盐浓度中可迅速生长，在浓度高时，生长反受到抑制。2.2 不同盐浓度肉汤培养基对菌株RIMD生长的影响接种副溶血弧菌RIMD菌株于不同盐浓度的肉汤培养基中，37恒温培养6h、24h后，分别测定其OD600值，后用Excel制成柱状图，见图3、4图3 副溶血弧菌RIMD株在不同盐浓度肉汤培养基培养6h后的OD600值图4 副溶血弧菌RIMD株在不同盐浓度肉汤培养基培养24h后的OD600值由图3和图4可知，由于Ca2+ 溶解度较小，有其本身的特殊性，盐浓度为12%时，所得OD值最大，而比较培养6h和24h数据时，可得出菌株RIMD在此种盐类的生长受培养时间的变化不大，由图知所得OD600与细菌浓度关系也不是十分密切；比较其他四组可得出，在盐浓度为3%时，菌株RIMD能够得到良好生长，在浓度为1.5%和6%时，细菌也能够得到正常生长，除MgCl2的盐浓度为0.375%时，细菌可良好生长外，其他三组在盐浓度12%或0.375%时，细菌生长受到明显抑制。2.3 不同盐类肉汤培养基对菌株VP12生长的影响 接种副溶血弧菌VP12菌株于不同盐类的肉汤培养基中，37恒温培养6h、24h后，分别测定其OD600值，后用Excel制成柱状图，见图5、6图5 副溶血弧菌VP12株在不同盐类肉汤培养基培养6h后的OD600值图6 副溶血弧菌VP12株在不同盐类肉汤培养基培养24h后的OD600值 由图5和图6可看出，菌株VP12在NaCl肉汤培养基生长存在明显的规律性，在盐浓度为3%左右时，细菌生长最佳，比较培养6h和24h时，在盐浓度为3%下，细菌增长最为迅速，同时1.5%、6%的NaCl肉汤培养基也较适宜细菌生长；KCl肉汤培养基对细菌生长的具有一定的促进作用，通过培养6h和24h可看出在盐浓度为1.5%6%时，细菌的生长正常，特别是在盐浓度为1.5%时，细菌增长最为显著，效果最明显，但当浓度高于12%和低于0.375%时，细菌生长不良；菌种VP12在MgCl2肉汤培养基的生长，由图可看出，菌株在不超过6%的浓度下生长极为良好，在高浓度下反抑制细菌的生长，有较强的规律性，同时在不同时间（6h和24h）下，细菌浓度得到充分增长，总之细菌可在此种盐类良好生长；菌株VP12在Na2HPO4肉汤培养基几乎不生长，不同浓度、不同时间对其影响都不大，细菌生长受到强烈抑制；CaCl2肉汤培养基培养不同时间对细菌的影响相对较小，在较低浓度下培养可得到较大OD600值。2.4 不同盐浓度肉汤培养基对菌株VP12生长的影响 接种副溶血弧菌VP12菌株于不同盐浓度的肉汤培养基中，37恒温培养6h、24h后，分别测定其OD600值，后用Excel制成柱状图，见图7、8图7 副溶血弧菌VP12株在不同盐浓度肉汤培养基培养6h后的OD600值图8 副溶血弧菌VP12株在不同盐浓度肉汤培养基培养24h后的OD600值 由图7和图8可知，由于Ca2+ 溶解性较小，故CaCl2肉汤培养基中的所得的OD值普遍较大，随培养时间变化不明显，且与其他各组比较，具有较大的差异性，故而决定了CaCl2培养基在五种盐类中的特殊性，即在较高盐浓度下存在结晶体析出现象；在比较其他四组，由上图可得出，细菌在3%盐浓度下可得到良好生长，在此浓度下细菌生长迅速，此种情况在NaCl、KCl、MgCl2三种盐类表现最为显著；同时可由以上两图再次验证副溶血弧菌在盐浓度为1.5%和6%可正常生长，仅次于浓度为3%时；除MgCl2肉汤培养基的盐浓度为0.375%时，细菌可良好生长外，其他三组在盐浓度12%或0.375%时，细菌生长受到明显抑制，所得OD600值都较小，且在不同培养时间下无变化或相对变化不明显。3 讨论副溶血弧菌又称嗜菌盐，广泛分布与海湾、海岸线区域、盐湖及海产品中，温热地带较多，是沿海地区引起微生物性食物中毒的重要病原菌。国家食源性疾病监测网数据显示，沿海省份副溶血弧菌的食物中毒已高居微生物性食物中毒的首位。该菌在水产品中的天然带菌率较高，温暖季节在海虾中可高达90%12，生长繁殖达一定量可引发人体病变，因此研究副溶血弧菌对盐类的需求及在不同盐浓度下生长状况，建立安全预警机制，具有重要的实际应用意义。本实验的结果可以得出，副溶血弧菌作为一种嗜盐性细菌，在1.5%-6%的较高盐浓度下是可以正常生长的，在低于0.375%或高于12%的情况下，细菌生长受到较为强烈的抑制，同时在盐浓度为3%左右，细菌生长良好，是其最适盐浓度，此规律在NaCl肉汤培养基中表现最为明显。比较五种盐类与细菌生长关系，由实验的几组数据可分析得，盐浓度超过1.5%的CaCl2肉汤培养基对细菌生长是起抑制性的或细菌无法在其中生长，因为在不同培养时间下，所得OD600值几乎不变化，而且测定的OD600值偏大，可能是由于钙离子溶解度较小，在实验过程中可看到较高浓度下的CaCl2肉汤中会出现一层白色絮状沉淀，对实验的数据整理及结果造成不可忽视的影响；菌株在Na2HPO4中的生长受到强烈的抑制，表现为所得OD600值在实验中均偏小，且随培养时间变化不大，故副溶血性弧菌在其中的生长所受抑制作用最强；而关于MgCl2的肉汤培养基，在较低浓度下对细菌的增长有明显的促进作用，浓度高时反而会抑制其生长或无明显的促进作用，此结论可通过以上四组柱状图观察得出，OD600值随不同盐浓度、不同培养时间变化极为显著；KCl肉汤培养基对细菌的生长所起效果并不是特别明显，细菌在其中生长随盐浓度的不同呈现出一定的变化规律，即在浓度为1.5%-6%时，细菌的生长处于较为适宜的状态，特别是在1.5%的盐浓度时，细菌增长得到最大值，在1.5%左右为细菌增长的最适盐浓度，而超过12%或低于0.375%，细菌在此浓度下的肉汤中几乎不生长；细菌在NaCl肉汤中的生长情况是最有其规律性的，在3%左右为其最适浓度，在盐浓度为1.5%-6%时可较为正常的生长，而超过12%或低于0.375%，细菌几乎不生长，且随培养时间变化不大。由于RIMD、VP12仅为副溶血性弧菌两种菌株，具有较强的相似性，且在不同盐类、不同盐浓度下的生长状况差异不明显，故两者之间的差距可忽略不计。细菌在NaCl肉汤培养基中的生长是符合副溶血弧菌的生理特性和生长规律的，具有较高的研究价值。本文对不同浓度盐环境副溶血弧菌生长的研究，将为海产品的日常加工、贮藏、检测、防疫提供一定的参考依据。4 小结副溶血弧菌作为一种典型的嗜盐性细菌，在高盐高渗环境下可良好生长，但当盐浓度过大，超过12%时，细菌生长受强烈抑制，而在生理浓度盐溶液中，细菌也几乎不生长。在不同盐类中生长亦存在一定的差异性，3% NaCl肉汤培养基是最适合生长的，而其在Na2HPO4和CaCl2肉汤培养基中细菌生长缓慢近乎不生长。致谢 值此论文完成之际，衷心地感谢我的指导老师：胡元庆，胡老师试验过程以及论文撰写过程中付出了很大的心血，在选题、试验设计、写作方面给予我精心的指导和修改。在此表示最真诚的感谢！祝愿身体健康、工作顺利、幸福美满。在此也同时向和我一起完成论文的吴子峰、汪渤同学致以诚挚的感谢！参考文献：1 王世杰,杨杰,谌志强,等. 19942003 年我国766 起细菌性食物中毒分析J.中国预防医学杂志,2006,7(3):180-184.2韩韫,蔡俊鹏,宋志萍,等.应用蛭弧菌清除海产品潜在致病弧菌的研究J.水产科 学,2005,24(11):23-25.3 Nish Ibuch IM, Kaper JB. 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