液相色谱柱的故障诊断与维护.doc

液相色谱柱的故障诊断与维护（二）液相色谱柱的故障诊断与维护（二）宽 峰* 在进样口到柱或柱到检测器之间，使用细的短的连接管 * 保证所有的管路接头都使用正确 * 用小体积检测池 * 减少进样量 Extra column dispersion looks like this.On one system with one column, the peaks are nice and sharp. On a different system or with a different column or chemist, the analysis looks like the one on the right. Tubing is the number one cause of this band broadening from dispersion. Make sure you are using short, small id tubing between the injector and column and between column and detector, eliminating as much additional dead volume as possible. If using a different system in a different lab, do not be fooled by the length of the tubing alone. Check the ID! Make sure all connections are made with matched fittings, as we will see later. This includes unions, column end fittings, and injector/detector fittings. Check to volume of the detector flowcell to make sure it is compatible with the column. Smaller id columns require smaller flowcell volumes if you would like to maintain the efficiency of the separation. Make sure your injection volumes have not increased due to a software programming error in the method. Check the microliters injected. Also check the sample concentration to make sure it is not 10 or 100 times more concentrated than you think, the attenuation will give this one away.柱外体积效应的影响压力I. 不进样时柱压连续升高- 泵密封垫- 流动相有颗粒- 流动相溶解性- 流动相的不稳定性 (聚合)- 形成柱死体积 (与使用条件有关)II. 进样时压力升高- 样品有颗粒- 样品在流动相中不溶- 样品组分与固定相不兼容保留值漂移I. 所有峰都向低保留值方向漂移（酸、碱、中性化合物）- 键合相流失- 流动相不稳定 (可能性较小)- 溶剂输送系统 (流速变化)II. 所有峰都向高保留值方向漂移- 在水/有机溶剂的混合体系中，有机溶剂含量减少- 柱改变 (可能性较小)- 溶剂输送系统 (流速变化)III. 离子型化合物的色谱峰的保留值漂移-流动相中挥发性组分损失 (离子强度, pH 漂移)- 柱改变 (键合相或污染)保留值漂移 I. 与流动相有关的问题- 使用新鲜的流动相 ?pH ?电导 ?色谱性能测试II. 与色谱柱有关的问题- 测试新柱- 用标准的测试混合样测试新柱- “清洗” 色谱柱后再测- 考虑样品基质与使用条件对柱稳定性的影响良好的柱使用规范在使用前过滤溶剂 完全润湿在运输中变干的色谱柱 了解溶剂对样品的溶解性及分离的影响 对含有保留性较强的杂质组分的样品要进行预处理 清除柱填料的局限性 pH 温度 化学兼容性 使用新鲜的水溶液，并考虑使用生物稳定剂（如叠氮化钠） 定期用强极性的溶剂清洗色谱柱 l储存色谱柱时，应冲净缓冲言，并用有机溶剂饱和色谱柱（乙腈） l避免外力损伤色谱柱：弯曲、跌落或将接头拧的过紧 Now lets cover some good column practices that will help you to increase your column lifetime. Filter solvents before you use them. The column is the HPLC systems best filter, so make sure the column isnt performing this task. Pretreat samples that contain strongly retained compounds of no interest. This means to remove any sample matrix, or contaminants, or incompatible analytes to the method/column. Solid phase extraction is good for this clean up. Avoid extreme column temperatures, greater than 60 degrees, or check the vendor limits. Some columns are now made for higher temperatures. Flush/clean the column often with strong solvents. Also use gradient cleaning. Keep the mobile phase pH between 3 and 7 unless otherwise indicated by the column vendor (polymeric phases). If it is necessary to do this, use a precolumn and expect a shorter lifetime. Always use fresh buffer solutions and aqueous mobile phases or treat them with sodium azide, this can be dangerous. Water solutions grow bugs or bacteria, these will contaminate and permanently modify the stationary phase. In line with the last point, prepare columns for storage by rinsing all of the buffer out of the column, then store in the appropriate solvent, at least 50% organic. This will keep bacteria from growing on the column. Make sure to rinse the buffer off first and with water, as many buffer salts precipitate in 100% organic. Then cap the column tightly to keep air out. Avoid physically mishandling the columns. This includes banging, dropping, overtightening fittings, and hitting your lab partner预柱与保护柱Here is a schematic illustrating the difference between a pre-column and a guard column. A pre-column is an in-line filter device for filtering solvents prior to the injection valve where the sample is introduced. A guard column protects the analytical column from sample contaminants that are strongly or permanently retained by the column phase. 带可重复使用接头及完整保护柱的卡套柱A more recent cartridge column design that we use at Hewlett-Packard is shown here.This design helps to incorporate in-line sample filtration and clean up devices, like filters and guard columns. A guard cartridge can be easily inserted into the column holders by reversing the collets at the front end. This requires no additional hardware and adds no additional delay volume with respect to the more traditional approach of two columns and tubing. This design also allows for truly resusable end fittings. Since the same column holder will fit any size HP-cartridge column of any of the offered phases, there is no need to remake the end fittings to accommodate a different column. The guards can help to automate some sample prep, and are inexpensive compared to traditional guard columns. 带Techtron保护柱的Zorbax 卡套柱制备样品: 流动相When manually preparing the sample, make sure to filter and remove particulates. Use a filter that is compatible with the sample solution. There are aqueous and organic filters. Dissolve the sample in the mobile phase if you can. If not, use a solvent that is different but weaker with respect to the mobile phase strength in the mode of HPLC you are using. Sometimes when the sample is dissolved in a different solvent, peak doubling can occur. Keep the sample volume as small as possible. Sometimes when a sample is partially soluble, it is attractive to add more mobile phase to dissolve the sample and the inject more volume for the same amount of sample mass on column. This only works to a point, then the bands become too broad and resolution is lost.在安装柱前后测试压力差如果柱压力太高，反装色谱柱，并用10-20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱，监测压力变化若出现沉淀 (如：蛋白凝聚、细胞物、聚合物) 设法用相应的可溶性溶剂，如 0.1% TFA / 80% 乙腈, 6M 盐酸胍, THF, HFIP若仍无效，应考虑更换过滤片色谱柱故障诊断与排除更换柱头过滤片色谱柱修复和再生化学变化由于键合相的水解或硅胶的溶解而造成的色谱柱填料的变化是不可逆的由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的清洗使之修复梯度洗脱的方式 (水 - 强有机溶剂) 通常最有效低 pH 流动相, 如 0.1% TFA or 0.01M H3PO4, 也是有效的升高温度（60-80）Example: 4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18 Flow rate: 1 mL / min; Temp: 80 A: 0.1% TFA in water B: 0.1% TFA in acetonitrile 100% A for 30 min.; 0-100% B over 30 min.; Hold 100% B for 30 min., Return to 100% A in 5 min. Repeat 3 times. l6M盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白质的沉积 lXDB, 有机聚合物等填料可使用高pH 水溶液 /有机溶液，如： 0.01M NaOH 50% 异丙醇 /水溶液，硅胶基质应尽量减少接触时间 (15-30 min). 总 结 如果使用时加以注意，大部分的液相色谱柱的问题是可以预防的 - 流动相必须是互溶的，无颗粒 - 使用保护柱和在线过滤器，并定期更换 - 使用恰当的样品制备方法 - 使用恰当的色谱柱清洗程序 - 不同类型的色谱柱，请选择不同的操作条件 (如： SB: pH 1-6, XDB: pH 3-11) - 保存柱反压及重要的色谱参数的记录 (如： R, N, As, k) - 色谱柱需保存在有机溶剂中 (乙腈)Agilent 1100 LC维护保养知识 1、 色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）2、 对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。4、带seal-wash的 1100，要配制90%水+10%异丙醇，以每分23滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。5、其它主意事项见说明书，或由现场工程师介绍。维护知识问答1、为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。样品过滤头的类型：30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2m和0.45m两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2m和0.45m两种规格,材料为纤维素。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2m和0.45m两种规格。处理样品体积为7l。滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐 用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。3、为什么Agilent 1100LC的流动相管路非常细?在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小45个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，Agilent 1100LC 使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。毛细管线分类：0.17mm内径 -绿色 ;0.12mm内径-红色。 PEEK 管线：内径 -0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。毛细管线优点: 柔韧性好. *Agilent 公司同时备有1/16in 的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户 ,优点是刚性好,但柔韧性差一些。 4、流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法比较： 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=47）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。A：请严格执行溶剂过滤。B：请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液C：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠. D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。6、Agilent 1100LC泵如何维护？Agilent 1100LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相，及时合理的维护非常重要。A：流动相使用前请必须脱气、过滤。B：使用缓冲盐时，要加在线Seal-wash选项。C：关机前，用 100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如甲醇），然后关泵，（适于反相色谱柱）。正相色谱柱用适当的溶剂冲洗D：及时更换Purge Valve内的过滤芯。（当打开Purge Valve时，压力高于10bar，表明过滤芯已堵）。E：使用合适的密封圈。7、如何选择合适的泵头活塞密封圈？泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同的密封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n0905-1420 2/pk）*注意：聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：0200bar；建议在泵的压力限制中，将最大压力设为200bar。8、使用梯度比例发时要注意那些事项？当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合