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文档简介

丁香1微升 （2.5U） Taq酶1微升 Taq酶缓冲液1微升（10mM） dNTPdna 50100ng灭菌水 补充到10微升体积72度 10分钟（建议水浴）若有dATP请使用dATP代替dNTP，这样的效率会高一些;反应体积可以根据你的DNA的量来确定，如果浓度比较小，可以扩大体系.加A后可用纯化试剂盒进行纯化或乙醇沉淀,有时就直接拿来连接,都有成功1. 由具有校正活性的DNA 聚合酶（如Pfu DNA 聚合酶）产生的PCR 扩增片段的纯化产物1-7l2.加入1l Taq DNA 聚合酶10反应缓冲液（含MgCl2）3.加入dATP 至终浓度0.2mM。4.加入5 单位的Taq DNA 聚合酶5.加去离子水至终反应体积为10l70孵育15-30 分钟6.采用1-2l 用于载体连接反应连接后转化感受态细菌，转化步骤：操作者需准备的材料（溶液配制参见章节XII. A） LB 平板（含有氨苄/IPTG/X-Gal） SOC 培养基1 每个连接反应准备2 个LB/氨苄/IPTG/X-Gal 平板，附加2 个平板测定转化效率（见章节VI.E），涂板前将平板平衡至室温（步骤10）。2 离心使连接反应内容物汇集到管底，取2l 连接反应产物加到置于冰上的1.5ml 离心管中（见注意事项1），向另一置于冰上的1.5ml 离心管加入0.1ng未酶切的质粒以测定感受态细胞的连接效率。3 将冻存的JM109 高效率感受态细胞从70冰箱中取出，放置在冰浴直至融化（大概5 分钟），轻轻振动离心管使之混匀。4 向步骤2 准备的每个转化管中加入50l 感受态细胞。（加入100l 细胞进行转化效率的测定）5 轻轻振动小管混匀，冰浴20 分钟。6 在精确的42水浴中热击4550 秒（不要振动）。7 迅速将管子移到冰浴中，使细胞冷却2 分钟。8 每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的950l SOC 培养基，而转化未酶切质粒的细胞加入900l SOC 培养基。（可加入LB 培养基，但得到的克隆菌数目可能会降低。）9 在37振荡培养（150rpm）1.5 小时。10 将每个转化培养基100l 涂到两个LB/氨苄/IPTG/X-Gal 平板上。对于转化对照，建议涂板时用SOC 培养基1：10 稀释。如果期望得到更高的克隆数目，可将细胞用1000 x g 离心 10 分钟沉淀，然后用200 l SOC 培养基重悬后，各取 100l 涂 2 块板。11 将平板于37过夜培养（1624 小时）。使用1108 cfu/g DNA 的感受态细胞，每个平板涂布100l，大约可得到100 个克隆。长时间孵育或将平板37过夜培养后贮存在4，有助于蓝白斑筛选。白色克隆菌一般包括插入子，然而，蓝色克隆菌也有可能包括插入子。注意：1. 实验证明使用大的（17100mm）聚丙烯管（比如Facon 公司产品，目录号：2059），可增加转化效率。实验时避免使用可结合DNA 的管子，因为其大大降低克隆
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