膨体聚四氟乙烯生物相容性、与角膜生物愈合特征的研究以及进口与国产两.doc

膨体聚四氟乙烯生物相容性、与角膜生物愈合特征的研究以及进口与国产两种材料的比较梁 丹 陈家祺 李永平 林健贤 陈紫卿目的： 对比研究国产与进口两种ePTFE的生物相容性及其与角膜的生物的愈合特征，寻找国产替代材料，观察植入物对角膜代谢的影响。方法： 将孔径50m、孔率88、厚200m的进口ePTFE与孔径45m、孔率84、厚200m的国产ePTFE制成8mm 直径圆盘植入兔角膜板层中，裂隙灯观察并照相，术后不同时间点分别处死动物进行光镜、投射电镜检查。结果： 角膜成纤维细胞能张入ePTFE的微孔内并成胶原，各时间点二组植入物网孔内成纤维细胞数与胶原含量相同；最长观察期7个月植入物稳定；进口与国产两组分别有6眼与3眼（p0.05）发生角膜脂肪变性。结论： ePTFE具有良好的生物相容性，能与宿主角膜产生生物愈合，植入ePTFE未造成严重的角膜营养代谢障碍。国产ePTFE具有与参数基本相近的进口ePTFE同样良好的生物形容性及与角膜生物愈合特性，国产材料的弹性较进口材料好。国产孔径45m、孔率84、厚200m的ePTFE可用于制作人工角膜的周边部。关键词：人工角膜 膨体聚四氟乙烯 生物相容性 生物愈合严重眼化学伤、热烧伤、天疱疮、Steven-Johnson综合症等造成的干眼及角膜新生血管等严重眼表疾病，用常规的角膜移植术失败率高达90100，用透明材料制作的人工角膜是目前治疗这类疾病唯一有效的途径。尽管个别病例获得得了长达15年的良好视力，但由于人工材料不能与宿主角膜产生生物愈合，致使术后角膜溶解、房水渗漏、人工角膜脱出、眼内炎等并发症发生率高，严重影响了人工角膜的临床应用。寻找能与宿主角膜产生生物愈合、不影响角膜代谢、能支撑中央光学柱镜、且具有良好生物相容性的人工角膜周边材料，是预防角膜溶解、减少植入物脱出的关键。近年来的研究表明有孔材料可能是理想的周边材料，法国Legeais的报导以及我们的研究提示有孔的膨体聚四氟乙烯（ePTFE)具有良好的生物相容性，角膜成纤维细胞可长入植入物的网孔内形成生物愈合。为了促进我国的人工角膜基础与临床应用研究，寻找ePTFE国产替代材料，我们对比研究了国产与进口ePTFE的生物相容性及其与角膜的生物愈合特性，并观察了植入物对角膜代谢的影响。材料与方法1、 植入材料：1.进口ePTFE：由法国巴黎圣母医院（Hotel-Dieude Paris）眼科教授Jean-MarcLegeais提供，孔径50m，孔隙率884，纤维直接8m，厚度200m；2.国产ePTFE：由上海塑料研究所提供，孔径45m，孔隙率84，纤维直接8m，厚度200m。用8mm直径环钻在ePTFE薄膜上取圆形植入材料，植入物用环氧乙烷消毒1小时，备用。2、 动物及其分组：54只新西兰白兔，分为2组：进口组26只：国产组28只。仅右眼手术。3、 手术方法：见梁丹报告，在角膜8点至4点时钟方位、角膜缘内11.5mm透明角膜上，作平行于角膜缘的板层角膜切口，继而作深度达2/3角膜厚度的板层剖切，将材料植于角膜板层间隙的中央区。4、 术后处理及观察：1地塞米松一新霉素滴眼液滴术眼，每天4次，连续3天。裂隙灯观察照相。术后21天拆线。5、 角膜新生血管分级：将角膜新生血管分为周边、1+、2+、3+四个等级。周边：新生血管仅位于缝线区域的角膜；1+：新生血管超过缝线区域，但不超过1/3角膜；2+：新生血管侵犯超过1/3角膜，但小于或等于2/3角膜；3+：新生血管侵犯超过2/3角膜，甚至整个角膜。6、 取材与光镜、电镜检查：从兔耳缘静脉注射空气分别于术后2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、7个月处死动物，摘出眼球，取材进行HE染色光镜检查以及透射电镜检查。7、 细胞密度计算方法：采用半定量的方法计数每个高倍镜下（400倍）植入物网孔内成纤维细胞的数量，每一标本取周边以及中央共6个视野计数，取平均值，分级方法：0：无细胞；1+：15个细胞；2+：610个细胞；3+：1130个细胞；4+：30100个细胞；5+：多于100个细胞。成纤维细胞的辨别方法：核大而圆或呈棱形，不分叶，胞浆丰富。结果早期死亡8例，至第14天时，存活46例。其他时间点共死亡5例。1、 大体观察：二组呈基本相同的大体改变，无角膜坏死、溃疡及植入物脱出。术手7天左右，新生血管自切口部位长入角膜，伴有角膜水肿、混浊，14天与21天时，上述体征仍较明显，以后逐渐减轻。1个月时眼部刺激症状几乎完全消失，血管逐渐萎缩。二组间第2、3周角膜新生血管范围比较见表2，统计学分析提示差异无显著性意义。表1 二组第2、3周角膜新生血管范围比较 时间组别血管范围第2周 第3周进口 国产 合计 进口 国产 合计周边123合计Fisherexact test711412312122026p0.0519236149575320973019p0.0514148339进口与国产组分别与有6眼与3眼于6周后在植入物浅层角膜出现细小、数量不等、不突出于角膜表面的白色状物，不伴有炎症反应。二组间发生率的比较（Fisherexact test），统计学分析提示差异无显著性意义。ePTFE外观白色不透明，术后2周左右出现透光性区域，平均于1个月左右，整个植入圆盘变得几乎透明。后期透明性以及外观明显改变。进口ePTFE植入后由圆形变成横椭圆形。而国产材料组无类似改变2.光镜检查：二组呈现基本相同的病理过程。HE染色显示：2周时植入物网孔内有红染的蛋白样物质以及个别成纤维细胞侵入，从2周至3个月网孔内成纤维细胞逐渐增多，3个月时最多，以后有所减少，4至7个月时数量基本稳定。早期，细胞为圆形，呈单核样，后期逐渐呈现棱形样改变。成纤维细胞在网孔内合成并分泌胶原，1个月时出现胶原样结构，3个月时胶原明显，且呈平行排列。不同材料的二组网孔内成纤维细胞以及胶原含量没有明显差异。进口组癌切片中，部分表现为植入瓦孔径塌陷，纤维皱缩，国产组植入物均匀一致，孔径明显，无塌陷。表2 不同时间点二组网孔内纤维细胞量的比较 时间组别2周3周1个月2个月3个月4个月7个月进口组国产组0+0+2+2+2+3+3+4+4+4+5+4+5+5+3+4+3+3+3+3.透射电镜检查：植入物为一半透明低密度物，其内有一些裂隙或网孔。2周标本，裂隙内能见到一些胶原纤维及细胞外颗粒状物质，散在分布，一些区域尚能见到圆形，不规则圆形，棱形的细胞，细胞内胞质丰富，多量粗面内质网及线粒体，为纤维母细胞样细胞。随时间延长，棱形细胞及胶原纤维增多，个别眼见到一些变性改变，部分区域胶原纤维间见一些边界清晰、棱形及杆形低密度裂隙。讨论总结以往的研究报告制作人工角膜良好的周边材料应具有以下四个条件：1、具有支持中央学光部的机械性能；2、具有良好的生物相容性；3、与宿主角膜牢固的附着、固定；4、不影响角膜组织的营养代谢。以往的研究表明有孔材料有利于角膜内营养物质的传递，当材料的孔径达到一定大小时，角膜成纤维细胞将长入网孔内并合成胶原，长入孔内的细胞及其合成的胶原像是树根长入泥土，使材料与角膜达到生物愈合的目的，从而提高人工角膜植入后的稳定性。Legeais等报告孔径50m、孔隙率88、厚度200m的ePTFE是较理想的人工角膜周边材料。通过与Legeais联系，我们获得了他们应用与临床以及实验的孔径为50m的ePTFE，并从上海塑料研究所，获得了孔径、孔隙率、厚度相近的ePTFE，对上述材料进行了对比实验研究。研究结果显示：国产与进口二组材料网孔内成纤维细胞数以及胶原量相同，说明具有同样的生物愈合特性。早期红染的蛋白样物质进入网孔内，逐渐出现增生活跃的纤维母细胞；3个月后胶原纤维化明显，透射电镜检查证实了网孔内增生活跃的纤维母细胞以及胶原的存在。部分植入ePTFE的眼在早期出现了角膜水肿以及明显的新生血管，这是宿主对植入材料的早期排异反应，是一种急性非感染性炎症反应。但这种早期反应并未影响植入物的稳定性，也未造成角膜长期的影响。因此我们认为ePTFE具有良好的生物相容性。进口与国产二组材料新生血管的范围基本相同。角膜板层内植入无孔非渗透性材料，干扰了角膜内营养物质、氧气、代谢产物的正常流动与沟通，在角膜组织内难以长久的存留。McCarey指出，如果材料有垂直于角膜表面的小孔，尽管是非渗透性材料，角膜都可以耐受，充填于有孔材料网孔内的角膜及质核液体可发挥渗透作用。材料的孔径大小、孔隙率以及厚度在一定程度上决定材料对角膜代谢的影响程度。本组观察9眼在植入物浅层角膜出现白色、细小点状物。透射电镜观察为胶原纤维间边界清晰的棱形及杆形低密度裂隙，与李永平关于脂肪变性的报道描述相似。推测可能是手术以及植入材料影响了角膜局部代谢，导致细胞合成脂肪增加，并释放到细胞外角膜基质间。Rondrigues等通过动物实验提出脂肪沉积是角膜细胞非特异性反应的结果。我们的研究显示所有脂肪沉积眼，病变范围局限、静止，不伴有植入物脱出，无组织溶解、角膜变薄等严重病变，因此我们认为目前参数的ePTFE可用于制作人工角膜的周边部。国产与进口二组材料脂肪变性的发生率相同。进口ePTFE植入角膜后呈横椭圆变形，在组织切片中，出现孔径塌陷，材料皱缩，而国产材料无类似改变，说明进口ePTFE的弹性较国产材料差。而弹性差不利于制作人工角膜周边部时与中央柱镜固定。从国产与进口二组材料植入后的稳定性、脂肪变性的发生率、网孔内成纤维细胞数量、胶原的含量、早期角膜新生血管范围等