毛细电泳法的进展与应用.doc

毛细电泳法的进展与应用摘要：对毛细管电泳进行了概述,分析了毛细管电泳的基本原理及进展，着重探讨毛细管电泳在医疗卫生药物分析以及蛋白质和多肽检测中的应用.关键字:毛细管电泳 药物分析 蛋白质 多肽 应用 进展1.毛细管电泳概述毛细管电泳是20世纪80年代后期分析化学，特别是生物分析化学的重大研究进展，也是目前发展最为迅速的电泳分离手段之一，又称“高效毛细管电泳（HPCE）”，它是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据试样中各组分间迁移率和分配行为上的差异而实现分的一类分离技术。毛细管电泳设备采用硅烷类石英毛细管柱作为分离部件，毛细管柱内50100m，电场强度可达1kV/cm，电流范围为1020mA。由于表面积大，散热迅速，并且分离时间短，有效地提高了分离效率。毛细管电泳具有快速、高效、高灵敏度、易定量、重现性好及自动化等优点，已广泛地应用于小分子、小离子、多肽及蛋白质的分离分析研究。它又在核酸分离方面显示出巨大的潜力。电流通过导体时产生焦耳热。传统平板凝胶电泳的最大局限性在于其无法克服两端高电压带来的焦耳热所产生的负面影响。焦耳热可使筛分介质内部出现温度、粘度及分离速度的不均一，影响迁移、降低效率、使区带变宽。由于这种负面影响与电场强度成正比，所以极大地限制了高电压的引入。也难以提高电泳速度。毛细管电泳使样品在一根极细的柱子中进行分离。细柱可减小电流，使焦耳热的产生减少；同时又增大了散热面积，提高散热效率，大大降低了管中心与管壁间的温差，减少了柱子径向上的各种梯度差，保证了高效分离。因此可以加大电场强度，达到100200V/cm，全面提高分离质量。2.毛细电泳技术在医疗卫生领域的应用2. 1 CE在药物成分分析中的应用目前 ,CE在天然中草药分析领域中的应用主要集中在生物碱和黄酮及其甙类方面 ,蒽醌类分析也有报道。生物碱有类似于碱的性质 ,在pH 7的缓冲液中利用 CZE 分离。纪秀红等选取马钱子碱为内标物 ,在磷酸/甲醇缓冲溶液中 ,测定了小檗碱、 巴马亭、 药根碱的含量。黄酮类化合物大多是中性分子 , 主要采用 MECC 模式分离。Li Y M以SDS(十六烷基磺酸钠)为阴离子表面活性剂将黄芩中的 6 种主要的黄酮类化合物分离。李伟等以磷酸盐为缓冲体系 ,利用 CZE模式分离、 测定了大黄提取液中离蒽醌化合物的含量。2. 2 CE在手性拆分中的应用CE因其高效、 快速、 选择性强的特点而成为目前最有效的手性拆分方法。各种 CE 分离模式皆可用于对映异构体分离 ,因此手性拆分成为 CE应用最活跃、 最独特的领域。其中 ,添加剂法只需向电泳缓冲液中加入合适的手性试剂 ,经过一定的分离条件优化即能实现手性分离。又因为可选择的添加剂种类很多 ,此法是 CE进行手性拆分的主要形式。目前 ,主要的手性添加剂有环糊精类(CDs) 、冠醚类、大环抗生素、蛋白质等。仅环糊精一类就有 CD , CD , CD , HP CD , CM CD , DM CD 等多种添加物质 ,其应用十分广泛。此外 ,其他种类添加剂的应用结合 MECC和 NACE 模式基本上能实现各种手性药物的拆分CE也可以用于药物生产过程全方位控制与检测 ,以保证药物质量 ,提高工艺水平。例如在优化氯苄律定合成的工艺中 ,以盐酸奎宁为内标 ,利用CZE分离了黄连素、 四氢黄连素和氯苄律定牛长群等成功利用 CE检测了青霉素发酵过程中的 5 种主要成分。CE还在体液中药物的测定、违禁药物分析和临床治疗诊断上有很广泛的应用。采用HPCE分析血清蛋白质获得的结果稳定，并能准确计算各蛋白质的相对浓度，避免了凝胶电泳法染色、脱色过程中多种影响因素造成的误差，而且HPCE法的结果重复性好，可信度高，便于贮存和检索。前白蛋白在血清中的浓度可以表明营养状态，而且是确定恶性肿瘤、炎症、肝硬化、何杰金氏病的重要指标，多数电泳法难以分辨，而用HPCE法很容易分离定量，检测波长为214或200nm。毛细管电泳（CE）增加了白蛋白部分的分辨率，这使得对双白蛋白血症检测的灵敏度有了很大的提高。HPCE与PCR联用可以用来对传染性疾病、肿瘤和遗传病进行分子生物学的诊断。以毛细管凝胶电泳分离血液中HIV-1的PCR产物，并采用紫外光和荧光检测，是应用较早的PCR产物的HPCE分析。研究急性白血病的蛋白质组学奠定了基础。KelvinHLee等用双向电泳发现脑脊液中的130131两个蛋白可作为CreutzfeldzJakob病的分子标记，这两个蛋白质属于14-3-3蛋白家族。丹麦的JECells系统研究了不同的膀胱癌组织样品，发现了一系列可用于肿瘤组织分级和区分肿瘤和正常膀胱上皮组织的分子标记如keratin 19和Psoriasin等。PFGE是一种非常有效的分子分型方法，在国外被广泛应用于很多菌种的分子流行病学研究中。能够用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源，在疫情控制方面可发挥重要的作用。利用脉冲场凝胶电泳分子分型追溯霍乱传染源，对20株受试菌株进行研究，通过研究得出，从电泳图谱来看，所有的这些供试分离株图谱相同，遗传相关性较近，可能来自同一克隆系。这20株菌既来自病人又来自带菌者，而且还有外环境和甲鱼中分离出来的菌，图谱和病人的图谱相同，这说明这几起疫情都是由食物引起的暴发；而这几起疫情发生前均有宰杀或食用甲鱼史，它们的遗传相关性较近，并且均为产毒株，提示携带霍乱弧菌的甲鱼可能是湖南省2005年霍乱流行的传染源之一。3.CE 在蛋白质分析中的应用3.1荷质比的测定CZE 是各种分离模式中最简单、应用最广泛的一种，它常被用于蛋白质荷质比的测定。在分离过程中，电荷决定了蛋白质运动的动力，而质量决定蛋白质运动的阻力，不同核质比的蛋白在管中的迁移速率不同，带正电荷且核质比最大的蛋白质最先通过检测窗口。缓冲液的选择对蛋白质的荷质比变化起决定作用，测定时一般以磷酸盐作为缓冲溶液，以获得较大的pH 值变化范围，同时以硼砂来抑制毛细管壁对蛋白的吸附5。3.2等电点的测定CIEF 是将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。通过管壁涂层或向缓冲液中加入添加剂（如CMC） 使电渗流减小，以防止蛋白质吸附及破坏稳定的区带，同时在两端分别插入酸和碱溶液中，加高电压后，就在毛细管内部建立pH 值梯度，蛋白质在毛细管内向各自等电点处迁移，形成明显区带，改变检测器末端贮瓶内的pH 值，就可以使聚焦蛋白质依次通过检测器而得以确认。在对样品进行测定之前，先对一系列已知等电点的蛋白质进行电泳，以等电点为纵坐标，以相对迁移率为横坐标制作标准曲线及公式，再通过测得未知蛋白的相对迁移率，即可求得其等电点。值得注意的是，由于检测窗口到负极尚有一段距离，使得等电点过高的蛋白质不能被检测，为了扩大对碱性蛋白的检测范围，通常在缓冲液中加入四甲基乙二胺，可以扩展碱性一侧的pH 值。4 .CE 在多肽分析中的应用4.1多台的分离多肽也是带电性的物质，相对蛋白质分子量较小，物理性质差异也不明显，因此当CE 用于多肽分离时，分离条件的选择很重要。毛细管分离的基本操作条件包括电泳电压、温度、毛细管尺寸、进样方法、检测条件等。同时，分离介质的选择和优化对多肽的分离和测定也有很重要的影响，主要包括缓冲试剂、添加剂、溶剂、pH 值、试剂浓度、筛分介质、分配相等的选择与优化。另外，毛细管管壁的改性也是提高分离效果的一个重要措施。4.2多肽纯度的鉴定提供高纯度的多肽样品，对其物化性质、生物活性及医药功能的研究皆很重要。目前多肽的纯度鉴定多用HPLC 法，但与HPLC 法相比，毛细管电泳则具有更高的分辨率和灵敏度，上样量也更少，一般仅为纳升级，相比HPLC 法对一些昂贵的肽进行分析更为经济。采用制备型液相色谱法获得的生物活性多肽，多采用CIEF 和CZE 联用的方法鉴定纯度。4.3多肽的结构分析毛细管电泳分离多肽酶解物所得的肽谱可提供多肽的结构信息。氨基酸排列顺序决定了肽的结构和功能，多肽氨基酸序列的测定对多肽的功能和性质研究具有很重要的意义。Howard P. Hendrickson 等发现用Ru （bpy） 3 3+ 化学发光检测未衍生的氨基酸与CE连用，可作为分离多肽和蛋白质的方法，其检出极限值比茚三酮法小。总之，毛细管电泳速度快，灵敏度高，可以对样品进行定性、定量分析及分离和纯化。不仅在医疗卫生药物分析方面应用广泛,而且在蛋白质和多肽的分析检测方面有着广泛的应用前景，具有巨大的开发应用潜力。参考文献:1.古卓良，周国华，张晓丹，等. 缓冲液种类对毛细管区带电泳分离蛋白质的影响 J . 解放军药学学报，2003，19 （6）：404-407.2.赵京山，温进坤，韩梅. 无胶筛分毛细管电泳检测微量蛋白质方法的建立与评价 J .河北医科大学学