接种、移栽情况调查.doc

接种、移栽情况调查（一）褐化 （酚污染）有些材料离体后很容易褐变，甚至接种后由于外植体不断分泌一些物质，使培养基变成褐色或淡赤红色，严重影响外植体的起动、分化和生长。这是初代培养过程中经常遇到的一个问题。1引起褐变的原因褐变产生的原因主要是由于外植体由自养变为异养，细胞代谢发生变化，产生一些植物碱，如单宁等酚类物质而引起的。这些酚类物质受多酚氧化酶激活，使酚类物质被氧化后产生醌类物质，这些物质一般呈棕褐色，随着植物体或愈伤组织褐变browning定义：在离体培养中，由于培养组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化，酚类物质被氧化棕褐色的醌类物质，使培养物及培养基变成褐色的现象。 引起褐变的因子：植物品种。有些植物材料不会褐变，而有些植物则很容易引起褐变；生理状态。一般分生组织产生醌类物质少，褐化程度低，而已经分化了的组织产生醌类物质多，褐化较严重；年幼的材料含醌类物质少，而成年的材料含醌类物质多。取材季节。一般冬春季取材褐变轻，夏秋季取外植体接种时褐变严重。培养基成分。培养基中无机盐成分高，附加植物激素浓度高。培养条件不当。以及培养温度高时，都可以使褐变程度加重。2防止褐变的方法（1）选择合适的外植体。根据影响褐变的因素来选择不容易引起褐变、并具有较强的分生能力的外植体。选用幼年的材料，且对取材的时期、季节，甚至于时间要进行试验，根据试验及前人的经验选择最合适的时期和部位进行接种。（2）加入抗氧化剂。使用抗氧化剂、半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体培养基的表层，或将刚切割的外植体浸入其中一定时间。（3）加入活性炭。活性炭是一种吸附剂，在培养基中加入0.5-2的活性炭可以明显地提高芽和根的分化频率。因为活性炭可以吸附组织培养过程中所产生的植物碱、醌、单宁等酚一类的有毒物资和气体，促进植物的生理活动及分化生长。但是由于活性炭的吸附作用是无选择性的，除能吸附有毒物质外，也能吸附其它有效的营养成分，因此，在配培养基时对其重要成分应适当多加一点。由于活性炭制作过程附着酸性，而且易产生沉淀，在调pH时一定多搅拌均匀，以免使培养基PH值过酸不凝固。（4）改变培养方式和条件。用静止的液体浅层培养，或放在摇床或转床上进行振荡和转动培养，都可以加快外植体与培养液之间的分子交换速度，加速褐化物质的外渗作用，促进外植体的代谢活动及物质的吸收，使外植体旺盛生长，可以大大减轻褐变。在初期进行暗培养及保持较低的温度（15-20）时，也能降低褐变作用。必要时也可以用液体振荡培养与固体培养交替进行，促进外植体早些摆脱褐变对它的不良影响，尽早进入生长分化阶段。（5）及时移动或更换新的培养基。外植体接种到固体培养基或液体培养基时，由于外植体不断分泌的植物碱等有毒物质渗透到培养基中，培养时间越长，培养基中的有毒物质就越多，特别是在外植体周围的培养基，往往引起褐色加深，其毒害加重。因此，接种后经常变更外植体在培养基上的位置，也可以减少有毒物质的积累和毒害的加重。经常更换新的培养基对克服褐变也是非常有效的措施。对容易褐变的材料可间隔1224小时培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理710天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。（二）玻璃化苗1玻璃化苗的症状及严重性玻璃化 vitrification定义： 植物组培过程中特有的一种生理失调和生理病变，表现为组培苗生长异常，幼叶和嫩梢呈半透明、水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩卷曲，脆弱易断，这种现象通常称为玻璃化。从进一步分析看出，玻璃化苗体内含水量高，而叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素等干物质含量低。光合作用能力和酶的活性降低，组织器官畸形，功能也不全，分化能力逐渐降低至完全丧失，严重时不能分化根。一旦形成玻璃化苗就很难恢复成正常苗，严重影响繁殖率，给生产造成很大损失。所以玻璃化苗问题是植物组织培养快速繁殖中亟待解决的问题之一。2产生玻璃化苗的因素（1）琼脂和蔗糖浓度的影响。琼脂浓度低，硬度差，玻璃苗发生较严重；相反，如果琼脂浓度和纯度增加，培养基硬度增加，玻璃化现象减少或不产生。蔗糖浓度增加也可以减少玻璃苗的产生，在一定范围内，蔗糖浓度越高，玻璃化苗产生的几率越低。琼脂和蔗糖会影响细胞的渗透压和水势。另外，用水培也比较容易形成玻璃化苗。（2）6-BA浓度对玻璃苗化的影响。目前快速繁殖中多数都用6-BA。6-BA除低廉（国产）外，它对很多植物芽的分化、苗的增殖是不可少的调节物质，所以一般在初代和继代培养过程中都离不开它，并且为了加速芽的分化往往用的浓度比较高。所以，试管苗继代时间越长，体内积累的6-BA浓度就越高。很多试验证明，培养基中6-BA浓度和玻璃化苗产生频率呈正相关，6-BA的浓度越高，玻璃化苗的比率越大。（3）培养瓶内空气湿度和通气条件的影响。培养瓶内空气湿度大，瓶壁内壁经常有水珠，另外培养瓶口密闭过严，瓶内气体与外界气体交换不畅，特别是当培养瓶分化芽丛已长满瓶，瓶内空气恶化，二氧化碳增多，此时常引起玻璃化苗很快形成。（4）不同植物材料的影响。不同植物的试管苗产生玻璃化苗的程度有很大差别，例如，草莓和无籽西瓜在同样的条件下培养，草莓不形成玻璃化苗，而无籽西瓜试管苗就很容易玻璃化。一般生长快的草本植物中禾本科植物如水稻、小麦、玉米试管苗不易产生玻璃化苗。（5）其他因素的影响。高温培养以及培养温度不稳定，一般也能促进试管苗玻璃化。另外，培养基中氮元素的含量过高，特别是氨态氮含量高时容易形成玻璃化苗。3防止和克服玻璃化苗的措施（1）增加培养基硬度。在固体培养时，适当增加琼脂的纯度，都可增加培养基硬度，从而造成细胞吸水阻遏，可降低玻璃化。（2）适当提高蔗糖浓度。提高培养基的糖浓度，可提高渗透压，降低培养基的渗透势，可减少培养材料水分的获得，造成水分的胁迫，材料不易过多积累水分。（3）改善培养瓶的通气条件。如用棉塞、有窗的封口膜封瓶口或瓶盖不要盖得太严，加一层通气垫等。（4）培养温度及光照的调节。适当降低培养瓶内温度，昼夜有一定温差比恒温效果好，但是温差不能太大，以免培养瓶内壁有水珠及培养基上有冷凝水。适当增加自然光照，能促进木质化，抑制玻璃化。（5）调节培养物质。增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe元素的含量，降低N和Cl元素的比例，特别是降低氨态氮的浓度，提高硝态氮的含量。（6）降低6-BA或其他细胞分裂素的浓度。此项措施是克服和减少玻璃化苗的重要措施。（7）对培养材料进行生根培养。当发现培养材料开始出现玻璃化现象时，应立即把未玻璃化的苗转入生根培养基诱导生根，只要生根后就不再玻璃化了。但是有玻璃化现象的无根苗转入生根培养基上也不会分行出根，甚至于提高培养基中的生长素浓度，仍诱导不出根。如果还需要继代培养，可从已生根试管苗上取顶芽或茎段进行芽的分化增殖培养。由于经过生根后起到小更新作用，避免玻璃化的产生，可以提高繁殖的速度。（三）污染组织培养是在无菌条件下进行的，若有微生物进入到培养瓶中，引起培养基和培养材料的污染，组织培养将无法进行。对于工厂化育苗来说，污染往往是影响生产任务按时完成的主要原因。以下根据污染产生的不同情况，提出一些解决办法。1材料污染引起材料污染一般有两种情况。一种是外植体灭菌不彻底，材料上带菌而进一步发展；另一种是操作过程中器具消毒、环境消毒等不彻底，带菌操作使没有污染的材料污染。以上情况如不注意将使污染迅速扩大。解决材料污染的方法：主要是在转苗前认真仔细地检查各项消毒工作是否严谨，转接试材中是否带菌。若发现材料有细菌或瓶壁及棉塞上有菌丝或孢子的一律挑出另行处理，千万不能漏掉。这种污染苗不能再用，如果是细菌轻度污染，还可酌情取出，做生根处理（组培和扦插），严重者只能倒掉。2接种污染如果外植体已经过了污染关，或者从其它实验室引进的无菌试管苗，在发展过程中又产生的污染，这些都是在转接操作时引起的污染。因此，如何保证转接继代培养时不发生污染，是一个重要技术问题。要使接种不被污染，除了对环境、仪器、超净工作台、操作器械、工具及所有辅助用品进行严格消毒外，操作者本人也应注意卫生，严格遵守无菌操作规程，不能有一点马虎。操作方法也很重要，要求熟练敏捷。在接种转苗时常用的有两种方法：（1）在超净工作台上，用已消毒冷却的枪型镊把材料从培养瓶中取出来，放到预先消毒过的培养皿（不锈钢盘）滤纸上，然后进行切割、分段，在用镊子将材料分别接种到新培养基中。正常情况下一瓶长满苗的培养瓶可转接5瓶左右。这种方法操作比较方便，切割材料的大小比较准确，操作比较快。要求经常换滤纸，工具要勤消毒，最好每转一瓶试管苗就换一次。（2）在超净工作台上，用已消毒冷却的弯型剪刀将培养瓶内的芽丛剪断，分块、分段后，再用枪型镊分别接种到新的培养基中，一般1瓶也可以分成5瓶左右。剪第二瓶时要换另一套已消毒冷却的工具。用这种方法剪截瓶中材料要求在酒精灯附近，虽然操作比较困难一些，但不容易污染。以上两种方法相比较，前者在培养皿和滤纸上进行分割虽然很方便，但非常容易引起交叉感染。相比之下还是用第二种方法安全，不易污染。无论用哪一种接种方法，一定要严把消毒灭菌关，确保工作环境、所用器械、工具、培养皿、无菌水等是无菌的。严格按无菌操作规程进行操作，如整个接种、转苗过程都要在火焰附近操作，特别要注意瓶口的灭菌，在转接时瓶子应倾斜，防止杂菌的侵入。另外，要保持大环境清洁无菌，定期进行清洁消毒，确保组织培养工作的顺利进行。 影响移栽成活的因素很多，其中的关键是培养健壮的生根试管苗。（1）生根壮苗的培养。 在转入生根培养之前要培养好无根的壮苗，同时在生根培养时，要求兼顾苗的生长，使生根过程也是培育壮苗的过程。培养时温度要适当降低，光照要加强，注意通气，起到蹲苗的作用，使试管苗矮壮。要把好生长素种类和浓度的关，对于有些容易生根的植物，生长素的浓度要低一些，也可以在无激素的培养基中生根。难生根的植物，可以用两种生长素，在能生根的前提下以低浓度为好，总之要根据所产生根的数量和质量来调整生根培养基。（2）试管苗的锻炼。炼苗的方法各地都有一些经验，最好是先将培养瓶移到温室内，放在自然光照下培养，同时昼夜有明显的温差，5天后再打开培养瓶的盖子，使瓶中空气湿度降低，通气加强，2天后可以移植。通过一周时间在培养瓶内炼苗，试管苗可大大提高适应能力，叶片角质层和蜡质层开始形成或加厚，空气可以适当的关闭或开放叶肉栅栏组织细胞排列逐渐紧密，茎秆的机械组织逐渐加强，这为移植的成功打下了基础。（五）遗传稳定性1影响遗传稳定性的因素遗传稳定性问题，即保持原有良种特性问题。植物离体快繁中通过愈伤组织诱导的苗木，有时会出现一些体细胞变异个体，其中有些是有益变异，但更多的是不良变异。诸如观赏植物不开花、花小或花色不正；果树不结果、抗性下降或果小、产量低、品质差等问题，在生产上造成很多损失。许多变异具有普遍性，即不限于某些物种，也不限于某些器官。遗传稳定性问题是植物离体快繁的一个重要问题。（1）基因型。 基因型不同，发生变异的频率也不同。例：在玉簪中杂色叶培养的变异频率为43，而绿色叶仅为1.2。香龙血树愈伤组织培养再生植株全部发生变异。嵌合体植株通过组培，其嵌合性更大。单倍体和多倍体变异大于二倍体。（2）继代次数。 试管苗的继代培养次数和时间长短影响植物遗传稳定性，是造成变异的关键因素。一般随继代次数和时间的增加，变异频率不断提高。变异与选用的植物材料年龄有关。由老龄材料培养的再生植株往往比幼龄材料培养的再生植株变异频率高。（3）发生方式。 不同离体器官发生类型，再生的试管苗遗传稳定性不同。一般说来，以茎尖、茎段等发生不定芽的方式繁殖，不易发生变异或变异率极低，能保持基因型基本不变；通过分化胚状体途径的再生植株变异较少；通过愈伤组织和悬浮培养分化不定芽的方式获得再生植株变异率较高。（4）激素浓度。 在高浓度的激素作用下，细胞分裂和生长加快，不正常分裂频率增高，再生