酶九章-核酶.ppt

第九章核酶工程 1981年Cech等发现四膜虫的核糖体前体RNA可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除内含子 完成加工过程 该具有催化活性的RNA的发现改变了传统上 酶是蛋白质 的观念 从此对具有催化活性的RNA 即核酶 ribozyme 的结构 催化机制以及应用的研究日益深入 核酸分子在总体的催化潜力上和蛋白质相差甚远 但由于可以遗传和变异而被自然界保留下来催化一些特殊的反应 核酶由于具有许多优点而受到重视 例如用于治疗的核酶注射入体内不会产生免疫原性 对具有切割活力的核酶可以更加自由的设计其切割RNA的位点 分子进化工程的诞生 使核酶的研究迅速发展 人工进化出自然界中不存在的多种功能的核酶 包括单链DNA酶 这些研究成果在理论和实际应用中都有着巨大的意义 传统观念 酶的化学本质是蛋白质 只有蛋白质才能有催化功能 核酸酶 RNA 只有蛋白质才能有催化功能 酶蛋白质 生物催化功能 上世纪80年代初Cech和Altman各自独立地发现 核酸酶 核酸酶 RNA DNA 多糖 氨基酸酯 进一步的研究发现 一种多功能的生物催化剂可以作用于 核酸酶的作用底物 一 天然核酶 目前为止 在自然界中发现的核酶根据其催化的反应可以分成两大类 剪切型核酶核酸酶剪接型核酶 核酸酶 剪切型核酸酶 剪接型核酸酶 异体催化剪切型或分子间催化剪切型核酸酶 自身催化剪切型或分子内催化剪切型核酸酶 核酸酶的分类 似乎最有应用前景 因为人们对它的剪切机制和分子结构要求已经有所了解 可以针对病毒核酸 不良基因或恶性基因进行人工设计 合成相应的各种RNA或DNA片段作为核酸酶基因 定向地剪切病毒核酸或不良基因以及它们的转录中间产物 抑制它们的表达 进行疾病治疗 1 剪切型核酶 催化自身或者异体RNA的切割 相当于核酸内切酶 主要包括锤头型核酶 发夹型核酶 丁型肝炎病毒 HDV 核酶 以及有蛋白质参与协助完成催化的RNaseP 核酸酶的结构 核酸酶的结构 锤头状模型 发夹模型 自身剪切的核酸酶的二级结构 2 剪接型核酶 实现mRNA前体自我拼接 具有核酸内切酶和连接酶两种活性 主要包括组I内含子和组II内含子 一锤头型核酶 R Symons等在比较了一些植物类病毒 抗病毒和卫星病毒RNA自身剪切规律后提出锤头结构 hammerheadstructure 状二级结构模型 它是由13个保守核苷酸残基和三个螺旋结构域构成的 后来Koizumi等证明只需要11个特定保守核苷酸 锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图a中N N 代表任意核苷酸 X可以是A U或者C 但不能是G I II和III是锤头结构中的双螺旋区 箭头指向切割位点 b是锤头型核酶的立体结构模型 白色链是核酶 灰色链是底物RNA分子 在磷酸骨架上结合有镁离子 Symons等认为 只要具备锤头状二级结构和13个保守核苷酸 剪切反应就会在锤头结构的右上方GUX序列的3 端自动发生 无论是天然的还是人工合成的锤头结构都由两部分构成 催化结构域 R 和底物结合结构域 S WilliamB Lott等提出了锤头型核酶催化反应的两种可能的化学机制 单金属氢氧化物离子模型 双金属离子模型 锤头型核酶的两种可能的催化机制以及HDV核酶的催化机制单金属氢氧化物离子模型 b 双金属离子模型 c HDV核酶中胞嘧啶充当一般碱进行催化的反应机理 二发夹型核酶 发夹型核酶的二级结构模型 50个碱基的核酶和14个碱基的底物形成了发夹状的二级结构 包括4个螺旋和5个突环 螺旋3和4在核酶内部形成 螺旋1 6碱基对 和2 4碱基对 由核酶与底物共同形成 实现了酶与底物的结合 核酶的识别顺序是 G C U NGUC 其中N代表任何一种核苷酸 这个顺序位于螺旋1和2之间的底物RNA链上 切割反应发生在N和G之间 三蛋白质 RNA复合酶 RNaseP 蛋白质 RNA复合酶主要催化tRNA前体成熟过程 例如S Altman和N Pace两个研究组合作发现的大肠杆菌tRNA5 成熟酶 蛋白质 RNA复合酶酶由蛋白质和M1RNA两个组分构成 蛋白质的分子量为20kDa M1RNA含有377个核苷酸 M1RNA单独具有全酶活性 蛋白质只是维护M1RNA的构象 实验证明来自不同原核细胞RNaseP中的M1RNA具有相似的三维结构 与前面几种剪切型核酶不同的是 RNaseP催化得到的产物的3 端是羟基 5 端是磷酸 四组I内含子和组II内含子 组I内含子 groupIintron 和组II内含子 groupIIintron 这类核酶比较复杂 通常包括200个以上核苷酸 主要催化mRNA前体的拼接反应 像蛋白质酶一样 内含子形成高级结构的折叠结果使关键残基形成活性部位 在辅助因子的参与下实现自身剪接 组I内含子能够自身剪接的是与它们保守的二级和三级结构有关 除了剪接之外 组 内含子还可催化各种分子间反应 包括剪切RNA和DNA RNA聚合 核苷酰转移 模板RNA连接 氨酰基酯解等 在体外 组 内含子的剪接是经过两个转酯化反应来实现的 无蛋白质参与 组 和组 内含子的主要差别是第一步反应的化学机制 在组 内含子中 外部的鸟苷的3 羟基作为进攻基团 而在组 内含子中是内部腺苷的2 羟基起作用 图7 4b 这个反应的结果形成一个带突环的内含子 3 外显子分子 其中第一个核苷酸经由2 5 磷酸二酯键与内含子的A相连 在第二步反应中 5 外显子的3 羟基进攻内含子 3 外显子连接点 结果是两个外显子相连 并释放出带有突环的内含子 核酶 脱氧核酶 的应用 基因治疗的概念出现在二十几年前 现在已经在临床上得到了实际应用 基因治疗最早的临床研究是1990年Blaese等进行的对腺苷脱氨酶 ADA 缺乏症的治疗 随后在对遗传病 病毒侵染 肿瘤等疾病的治疗中得到广泛的应用 中国也是开展基因治疗比较早的国家 1991年薛京伦等开展了血友病B基因治疗的临床实验 并取得比较理想的效果 基因治疗的主要策略可以分为 1 向体内导入外源基因取代体内的有缺陷的基因发挥作用 2 对致病基因进行抑制 其中 第二种方法是用反义核酸或核酶通过干涉致病基因的转录或翻译而清除其表达产物 对医疗应用来说最主要的还是那些具有切割特定RNA顺序 从而可以在体内抑制某些有害基因的核酶 利用核酶或脱氧核酶抑制有害基因的基本原理 组I内含子核酶可以用来修复体内的有害突变基因 为修复型基因治疗开辟了一个很有发展前景的途径 药用核酶应用情况 脱氧核酶抑制有害基因表达的研究情况 在治疗人类疾病方面 核酶 脱氧核酶 在防治动 植物病毒侵害以及基因组研究等分子生物学实验中也有一定的应用 例如田波等设计了针对