酶工程实验2012.doc

2007级生技班酶工程实验 学号：2007083姓名： 班级：07生物技术班 日期：2010-11-13 酶工程实验报告实验一 木瓜蛋白酶的分离纯化及酶活检测一、实验原理以半胱氨酸内肽酶为主（包括木瓜蛋白酶，简称PAP、木瓜蛋白酶，简称CAR、木瓜凝乳蛋白酶，简称CHP和木瓜凝乳蛋白酶M，简称GEP）的木瓜蛋白酶是从植物番木瓜中分离纯化而得的一种混合酶。这种酶广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中以为成熟的果实乳汁中含量最高，约占乳汁干中的40%。其最大的用途是在食品工业方面，防除啤酒冷藏混浊，嫩化肉类，生产调味品，烘烤面包，乳酪制品及谷类和速溶食品的蛋白质强化生产。在动物饲料加工方面，用于鱼蛋白浓缩物和油籽饼处理，能提高氮的可溶性指数和蛋白质的可分散指数。少量在皮革工业作软化剂、纺织工业作丝织品脱胶清洁剂和废胶卷回收报等。在医药方面，主要用于治胃炎、消化不良以及用于肉赘摘除、伤痕处理、脱毛、清洁皮肤和新近的裂腭整形外科及制木瓜凝乳蛋白酶注射剂治疗脊骨盘脱出症等。木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，其专一性较差，能分解比胰脏蛋白酶更多的蛋白质。木瓜蛋白酶是单条链，有211个氨基酸残基组，相对分子量23000。木瓜凝乳蛋白酶，相对分子量36000，约占可溶性蛋白质的45%。溶菌酶，相对分子量2500，约占可溶性蛋白质的20%。木瓜蛋白酶为白色、淡褐色无定型粉末或颗粒。略溶于水、甘油，不溶于乙醚、乙醇和氯仿。水溶液无色至淡黄色，有时呈乳白色。最适pH为5.08.0，微吸湿，有硫化氰臭。最适温度65，易变性失活。木瓜蛋白酶等电点pH9.6。半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA是木瓜蛋白酶激活剂，巯基试剂和过氧化氢是木瓜蛋白酶的抑制剂。二、实验目的1、学习和掌握木瓜蛋白酶分离纯化的原理、方法和工艺过程，包括盐析、酶活力保护、结晶与重结晶。 2、掌握木瓜蛋白酶活力的测定方法和原理。3、掌握蛋白质分离纯化的工艺流程，特别是盐析操作技术的熟练掌握；4、酶活力检测方法的掌握。三、实验材料 青木瓜、河沙、硅藻土4、 实验药品 半胱氨酸、（NH4)2SO4、NaCl、酪蛋白、TCA溶液、酪氨酸、标准液(50g/ml)5、 实验仪器 研钵、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅。六、实验原料准备（1）木瓜乳汁的采集及采后处理 在海师校园中摘取不同生长程度的青木瓜，用锋利刀片在未成熟的青果表面纵割34条线，下刀深度在2mm左右，用冰冻的大烧杯接收流下的乳汁。割后3060s乳汁停止流出，用刀片把粘在果上的乳汁刮入大烧杯中。将采集好的木瓜乳汁置于4冰箱中备用。（2）酶稀释液：半胱氨酸0.03mol/L（0.1537g）、EDTA.2Na0.00603mol/L（0.0935g），两者分开用适量蒸馏水溶解，再将EDTA.2Na溶液倒入半胱氨酸溶液中，使其溶解，调节至pH 4.5，定容至25ml。（3）酪蛋白溶液(底物)：称磷酸氢二钠1.447g加蒸馏水约80ml，溶解后加入0.80g酪蛋白，水浴上加热搅拌溶解，待完全溶解后，冷至室温，调pH至7.0，定容至100ml，摇匀。（4）TCA溶液(变性剂)：称三氯醋酸(TCA)2.247g，乙酸钠1.824g，冰醋酸2g，定容至l00ml。（5）酪氨酸标准液(50g/ml)：称105烘至恒重的酪氨酸5.0，用0.1 mol/L HCl定容至100ml。七、实验过程1、木瓜蛋白酶的分离纯化(1)粗提：称取木瓜乳汁(21g)、硅藻土(10g)和筛选过的砂子(15g)混匀，在室温下加25ml半胱氨酸溶液，(0.04mol/L，pH5.7)，在研钵中充分磨匀，静置后倾出上清液，再用25ml半胱氨酸溶液重复研磨和洗提，然后用半胱氨酸溶液定容到100ml(粗体积)，用布氏漏斗过滤约剩下65ml。(2)除不溶物：取45ml滤液于小烧杯中，在搅拌下慢慢加入1mol/LNa0H溶液调pH至9.0，用30个1.5ml离心管盛装，离心(4,8000rpmmin，10min)，取上清液。(3)（NH4)2SO4分级分离：取上清液于小烧杯中，加入9.72g(NH4) 2SO4至40%饱和溶液（1L：243g），静置2h。离心(4,8000rpmmin，10min)，弃上清液，用饱和(NH4) 2SO4溶液洗沉淀一次，EP中有明显的白色沉淀，将所有沉淀全转移到一个小烧杯中。(4)NaCl分级沉淀：向小烧杯中添加30ml半胱氨酸溶液(0.02mol/L，pH7.0)，慢慢加入2.53g固体NaCl，静置lh，在分装到1.5mlEP管中离心(4,8000rpm/min，20min)弃上清液，再将各管中的沉淀转移到统一小烧杯中。(5)结晶：在沉淀中加20ml半胱氨酸溶液(0.02 mol/L，pH5.7)，立即调pH至6.5，静置30min，置于4下过夜，小烧杯底部只有很少量的白色结晶析出，在4下离心(8000rpm/min，25min)，未收集到明显的结晶。(6)重结晶：2、木瓜蛋白酶活性测定(1)样品处理：在盛装结晶（样重约0.01g）的1.5ml离心管中加入酶稀释液500ul，混匀盖严，将酶激活15min以上(激活时半胱氨酸的浓度要高于0.03mol/L，而且要当天配制，激活的酶最好在2h内测完)备用。(2)木瓜酶活力测定：将已激活的酶液置于37水浴保温10min ,吸取预热37酪蛋白液500ul加入此管，在37反应10min,立即加入300ul，TCA摇匀；另取已激活的样液500ul，加入300ul TCA，37保温10min后立即加入预热37酪蛋白液500ul，摇匀。以后管为对照，测前管的OD275值，即A=1.581。另取酪氨酸标准液，以蒸馏水作空白对照，测OD275值，即As=0.318。As：50ug/ml酪氨酸的光吸收值；A：1ml激活酶作用于底物所得产物的光吸收值；50：标准酪氨酸的微克数/毫升；10：反应时间(min)；500：酶第一次稀释倍数(定容体积)；3:激活时酶液的稀释倍数；11：测定时酶液的稀释倍数。八、实验结果1、未制得新鲜的木瓜蛋白酶2、样品木瓜蛋白酶活力=1.58150（5003）11（100.01）=13043259、 实验分析 1、对木瓜乳汁样品的采集没有正确的估计，虽然采集了大量的青木瓜（约80个）仍没有采集到所需量的新鲜木瓜乳汁，直接影响整个实验的进程和效果。 2、由于实验室条件的限制，不得不将将溶液置于1.5mlEP管中离心，致使本来就比较稀少的酶量丢失。 3、试验中不应来回的将沉淀在EP管和小烧杯中转移，由于此操作的的影响导致在结晶的过程中只有极微量的晶体析出。 4、由于结晶的晶体很稀少致使重结晶过程完全没有收集到结晶。 5、由于测吸光值时运用的石英比色皿是坏损的，造成测量数据的方法性错误，仅留下一组正确数据。6、由于实验的操作过程与原计划完全不一致，而人采用原来的计算公式，所以木瓜蛋白酶的活力测定数据不具有说服力。实验二 尼龙固定化木瓜蛋白酶及其应用研究1、 实验原理 酶通过固定化后可以提高其酶的稳定性及分离纯化的效率二、实验目的：1、掌握尼龙为载体戊二醛为交联剂对木瓜蛋白酶进行固定化的方法。2、了解检验固定化酶活力的方法。三、实验材料 尼龙(6)或(66)，市售140目四、实验药品焦亚硫酸钠、硅藻土和河沙、半胱氨酸、（NH4)2SO4 、NaCl、EDTA.2Na、磷酸氢二钠、酪蛋白(进口分装)、三氯醋酸(TCA)、乙酸钠、冰醋酸、酪氨酸、氢氧化钠、石英砂、磷酸氢二钠、酪蛋白、戊二醛(E . Meyck)、考马斯亮蓝G-250(sigma) 、CaCl2、甲醇、 HCl、磷酸缓冲液、95%乙醇、磷酸、牛血清白蛋白五、实验仪器 ph计、25ml，100ml容量瓶、研钵 、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、布氏漏斗五、实验过程1、固定化木瓜蛋白酶制备将尼龙布剪成约2g左右的小方块，置于干净培养皿中，用含18.6% CaCl2和18.6%水的甲醇溶液处理10min，洗净吸干。再用3.65mo1/L HCl水解45min，洗至pH中性，吸干。用5%戊二醛(25%水的戊二醛溶液和硼酸缓冲液配制)20交联20min，用0.1 mol/L pH7.8磷酸缓冲液洗除多余戊二醛。将2g（一小块）处理尼龙布剪成小块放入1.5ml离心管中，立即加入1mg/mL酶液(0.1g木瓜蛋白酶溶于0.1 mol/L pH 7.2磷酸缓冲液并定容至100mL，活力44.7U/mL，比活力205 U/mg蛋白)至满管，置于4-15冰箱中固定3h。用0.1 mol/L pH7.5磷酸缓冲液(含0.5mo1/L NaCl)洗至洗脱液在280nm波长处无光吸收，木瓜蛋白酶即固定在尼龙布上。2、酶活力及蛋白质含量测定取O.1mL酶液加入0.9mL激活剂(上述缓冲液内含20 mmol/L Cys, 1 mmol/L EDTA)37保温恒定，加人同样预热的1 %(W/V)酪蛋白溶液(上述缓冲液配制)1 mL,37反应10min，加人3mL10%三氛乙酸(TCA)溶液终止反应(对照管先加TCA，后加底物)。275nm波长下比色。在上述条件下每增加1个光吸收单位的酶量为1个酶活力单位(U)。取0.1g固定化酶加入1mL激活剂其余同溶液酶活力测定。蛋白质含量测定，按考马斯亮蓝G-250法。3、考马斯亮蓝G-250法称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶解于50mL95%乙醇中，再加入100 mL85%（W/V）的磷酸，混匀，配成原液。临用前取原液15mL，加蒸馏水稀释至100mL,双层滤纸过滤，即为缓冲液A，4保存。0.5mg/mL标准牛血清白蛋白溶液的配制：准确称取5mg牛血清白蛋白，溶解于适量的蒸馏水后，用缓冲液A定容至10mL。（1）牛血清白蛋白标准曲线的测定取6支试管，按下表加入标准蛋白溶液和缓冲液A。管号01234标准蛋白溶液/uL04080120160缓冲液A/ uL500460420380340标准蛋白含量/mg.mL-100.040.080.120.16在各管中分别加入5mL缓冲液A，混匀，室温放置2min。以0号管为空白对照，用1cm光程比色杯测量各样品在波长595nm下的吸光度A595。以A595为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上标准曲线。（2）样品蛋白质含量的测量取样品溶液500uL,再加入5mL缓冲液，混匀，室温放置2min，测量其在波长595nm下的吸光度A595。再根据标准曲线查出相当于标准蛋白的量，从而计算样品的蛋白质浓度（mg/mL）。管号12345吸光值0.2300.3590.4200.4570.547重复10.2260.3540.4260.4540.549重复20.2220.3530.4260.4550.548平均值0.2260.3550.4240.4550.5486、 实验结果管号正对照负对照要测得蛋白含量的管吸光值0.1860.0700.129重复10.1850.0780.129重复20.