第十章紫外-可见分光光度法.ppt

04 00 46 第十章紫外可见分光光度法 一 光的波粒二象性二 电磁波谱和各种光三 物质对光的吸收四 电子跃迁类型五 常用概念六 吸收带与结构关系 第一节紫外可见光度法基本原理 04 00 46 分光光度法 是基于被测物质对光的选择性吸收而建立的分析方法 应用对象 一般是能吸收UV ViS的分子或某些特定离子本章重点 1 光的波粒二象性 2 紫外可见分光光度法基本原理和概念 3 定性定量方法 04 00 46 一 光的波粒二象性 波动性 粒子性 E 光的折射 光的衍射 光的偏振 光的干涉 光电效应 E 光子的能量 J 焦耳 光子的频率 Hz 赫兹 光子的波长 cm c 光速 2 9979 1010cm s 1 h Plank常数 6 6256 10 34J s焦耳 秒 04 00 46 二 电磁波谱和各种光 紫外可见光谱区为200 800nm其中紫外为200 400nm 可见为400 800nm在此区域主要是某些分子产生的吸收 04 00 46 单色光 复合光 光的互补 单色光 复合光 光的互补 单一波长的光 由不同波长的光组合而成的光 若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光 那么就称这两种单色光为互补色光 这种现象称为光的互补 04 00 46 三 物质对光的吸收 1 物质的颜色与光的关系 完全吸收 完全透过 吸收黄色光 光谱示意 表观现象示意 复合光 吸收池 黑色 无色透明 互补色 04 00 46 2 物质的吸收原理与光的关系 光作用于物质时 物质吸收了相应波长的光 而显示出特征的颜色 这一过程与物质的性质及光的性质有关 物质对光的吸收具有选择性 量子化 物质对光的吸收满足Plank条件 04 00 46 物质的电子结构不同 所能吸收光的波长也不同 这就构成了物质对光的选择吸收基础 原子吸收是锐线光谱 分子吸收是带状光谱 例 A物质 B物质 同理 得 1ev 1 6 10 19J 04 00 46 3 物质吸收光谱 曲线 的类型 测量某物质对不同波长单色光的吸收程度 以波长 为横坐标 吸光度 A 为纵坐标 绘制吸光度随波长的变化可得一曲线 此曲线即为吸收光谱 表示某物质吸收光谱的位置用 max 表示物质吸收光谱的强弱用 吸光系数 04 00 46 吸收光谱AbsorptionSpectrum 原子内电子跃迁 分子内电子跃迁 带状光谱 锐线光谱 对光吸收程度 对光吸收程度 04 00 46 吸收曲线的讨论 同一种物质对不同波长光的吸光度不同 吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长 max 不同浓度的同一种物质 其吸收曲线形状相似 如右图 且 max值不变 而对于不同物质 它们的吸收曲线形状和 max则不同 吸收曲线可以提供物质的结构信息 并作为物质定性分析的依据之一 04 00 46 不同浓度的同一种物质 在某一定波长下吸光度A有差异 在 max处吸光度A的差异最大 此特性可作为物质定量分析的依据 在 max处吸光度随浓度变化的幅度最大 所以测定最灵敏 吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据 04 00 46 1 有机化合物价电子类型有机化合物中存在三种价电子 电子 电子 n电子它们对应有 及n轨道 如甲醛分子 分子轨道理论 成键轨道 反键轨道 当外层价电子吸收紫外或可见辐射后 就从基态向激发态 反键轨道 跃迁 主要有四种跃迁 所需能量 大小顺序为 n n 四 电子跃迁类型 04 00 46 2 电子跃迁类型 1 跃迁 所需能量最大 电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁 饱和烷烃的分子吸收光谱属于该类跃迁 出现在远紫外区 吸收波长 200nm 例 甲烷的 max为125nm 乙烷 max为135nm 只能被真空紫外分光光度计检测到 作为溶剂使用 04 00 46 2 n 跃迁 所需能量最小 n电子只有吸收近紫外光的能量才能发生跃迁 含有杂原子不饱官能团的分子吸收光谱属于该类跃迁 出现在近紫外区 吸收波长 200nm 吸收强度较弱 又是检测不到 例 丙酮中羰基能产生该类跃迁 其 max为279nm 为10 30 04 00 46 3 n 跃迁 所需能量较大 吸收波长多为150 250nm 大部分在远紫外区 而在近紫外区的仍不易观察到 含非键电子的饱和烃衍生物 含N O S和卤素等杂原子 均呈现n 跃迁 如下表所示 04 00 46 4 跃迁 最重要的跃迁 所需能量较小 吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区 max一般在104L mol 1 cm 1以上 属于强吸收 a 不饱和烃 跃迁乙烯 跃迁的 max为165nm max为1 104L mol 1 cm 1 强吸收 b 共轭烯烃中的 04 00 46 共轭烯烃中 跃迁所需能量降低 因此 对应波长增大 同时也属于强吸收带如 max 217nm max为21000 紫外光谱电子跃迁类型 n 跃迁 跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构 推测可能产生的电子跃迁类型 根据吸收谱带波长和电子跃迁类型 推测分子中可能存在的基团 分子结构鉴定 04 00 46 五 常用概念和术语 3 生色团 最有用的紫外 可见光谱是由 和n 跃迁产生的 这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团 这类含有 键的不饱和基团称为生色团 简单的生色团由双键或叁键体系组成 如乙烯基 羰基 亚硝基 偶氮基 N N 乙炔基 腈基 CN等 04 00 46 4 助色团 有一些含有n电子的基团 如 OH OR NH NHR X等 它们本身没有生色功能 不能吸收 200nm的光 但当它们与生色团相连时 就会发生n 共轭作用 增强生色团的生色能力 吸收波长向长波方向移动 且吸收强度增加 这样的基团称为助色团 5 红移与蓝移 有机化合物的吸收光谱常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长 max和吸收强度发生变化 max向长波方向移动称为红移 向短波方向移动称为蓝移 或紫移 吸收强度即摩尔吸光系数 增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应 04 00 46 04 00 46 六 吸收带与分子结构的关系 电子跃迁类型与分子结构及其存在的基团有密切的联系 因此 可以根据分子结构来预测可能产生的电子跃迁 或者根据吸收谱带来推测分子的结构 例如 饱和烃只有 跃迁 烯烃有 跃迁也有 跃迁 醛 酮同时存在 n n 四种跃迁而产生相应的吸收带 1 R吸收带 特殊基团带 由n 电子跃迁而产生的吸收带 是杂原子的不饱和基团这类生色团的特征 处于 300nm 是弱吸收 有时被掩盖 6 强带和弱带 在紫外可见光区内 凡是 max值大于104的吸收峰为强带 小于102的吸收峰为弱带 04 00 46 2 K吸收带 共轭作用 由于非环状共轭双键中的 跃迁而产生的吸收带 该吸收带属于强吸收带 3 B吸收带 芳香族特征带 由于苯分子的振动和转动能级跃迁产生的吸收带 在230nm 270nm出现 属于较弱的吸收带 在蒸汽时出现精细结构 很多小锯齿峰 在极性溶液中精细结构消失 出现宽峰 4 E吸收带 芳香族特征带 由苯环中环状共轭系统的 跃迁而产生的吸收带 04 00 46 该吸收带特点是产生两个紧相邻的E1 在180nm处 E2 在200nm处 带 该吸收带均属于强吸收带 04 00 46 第十一章紫外可见分光光度法 一 朗伯 比尔定律二 偏离吸收定律因素 第二节溶液吸收定律 04 00 46 一 朗伯 比尔定律 1 透光率 透射比 Transmittance 透光率定义 T取值为0 0 100 0 全部吸收 T 0 0 全部透射 T 100 0 04 00 46 2 吸收定律的推导 简化 Lambert BeerLaw I0 It dI NI N 薄层中的吸光粒子数 N N0cdSdb N0 阿伏加德罗常数 dS 捕获面积 薄层中被光照射的面积 c 吸光溶液的浓度 N k cdb 故dI NI Ik cdb dI Ikcdb dI I kcdb 积分 得 或 得 04 00 46 3 吸光度与透光率 T 透光率 A 吸光度 T T 0 0 A T 100 0 A 0 0 A 0 434 T 36 8 04 00 46 4 吸光系数Absorptivity b 吸光液层的厚度 光程 cm c 吸光物质的浓度 g L mol L K 比例常数 入射光波长 物质的性质 温度 取值与浓度的单位相关 c mol L K 摩尔吸光系数 L mol 1 cm 1 c g L K a 质量吸光系数 L g 1 cm 1 c g 100mL K 比吸光系数 相互关系 溶剂 04 00 46 5 吸光度的加合性 多组分体系中 如果各组分之间无相互作用 其吸光度具有加合性 即 二 吸收定律偏离的因素 标准曲线法测定未知溶液的浓度时 发现 标准曲线常发生弯曲 尤其当溶液浓度较高时 这种现象称为对朗伯 比耳定律的偏离 引起这种偏离的因素 两大类 1 物理性因素 即仪器的非理想引起的 2 化学性因素 04 00 46 1 物理性因素 难以获得真正的纯单色光 朗 比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带 复合光可导致对朗伯 比耳定律的正或负偏离 非单色光 杂散光 非平行入射光都会引起对朗伯 比耳定律的偏离 最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离 04 00 46 非单色光作为入射光引起的偏离 假设由波长为 1和 2的两单色光组成的入射光通过浓度为c的溶液 则 A1 lg o1 t1 1bcA2 lg o2 t2 2bc故 式中 o1 o2分别为 1 2的入射光强度 t1 t2分别为 1 2的透射光强度 1 2分别为 1 2的摩尔吸光系数 因实际上只能测总吸光度A总 并不能分别测得A1和A2 故 04 00 46 A总 lg o总 t总 lg Io1 o2 t1 t2 lg Io1 o2 o110 1bc o210 2bc 令 1 2 设 o1 o2A总 lg 2Io1 t1 1 10 bc A1 lg2 lg 1 10 bc 讨论 因实际上只能测总吸光度A总 并不能分别测得A1和A2 故 04 00 46 讨论 A总 A1 lg2 lg 1 10 bc 1 0 即 1 2 则 A总 lg o t bc 2 0若 0 lg 1 10 bc 值随c值增大而增大 则标准曲线偏离直线向c轴弯曲 即负偏离 反之 则向A轴弯曲 即正偏离 04 00 46 讨论 A总 A1 lg2 lg 1 10 bc 3 很小时 即 1 2 可近似认为是单色光 在低浓度范围内 不发生偏离 若浓度较高 即使 很小 A总 1 且随着c值增大 A总与A1的差异愈大 在图上则表现为A c曲线上部 高浓度区 弯曲愈严重 故朗伯 比耳定律只适用于稀溶液 4 为克服非单色光引起的偏离 首先应选择比较好的单色器 此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处 04 00 46 2 化学性因素 朗 比耳定律的假定 所有的吸光质点之间不发生相互作用 假定只有在稀溶液 c10 2mol L时 吸光质点间可能发生缔合等相互作用 直接影响了对光的吸收 故 朗伯 比耳定律只适用于稀溶液 溶液中存在着离解 聚合 互变异构 配合物的形成等化学平衡时 使吸光质点的浓度发生变化 影响吸光度 例 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡 CrO42 2H Cr2O72 H2O溶液中CrO42 Cr2O72 的颜色不同 吸光性质也不相同 故此时溶液pH对测定有重要影响 04 00 46 第十章紫外可见分光光度法 一 基本组成二 分光光度计的类型三 仪器测量误差四 实验技术及分析条件 第三节紫外 可见分光光度计 04 00 46 一 紫外 可见分光光度计组成 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 I0 It 参比 样品 未考虑吸收池和溶剂对光子的作用 04 00 46 1 光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射出连续光谱 要求 具有足够的辐射强度 较好的稳定性 较长的使用寿命 可见光区 钨灯作光源 其辐射波长范围在320 2500nm 紫外区 氢 氘灯 发射185 400nm的连续光谱 2 单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并从中选出需要的波长 入射狭缝 光源的光由此进入单色器 准光装置 透镜或返射镜使入射光成为平行光束 色散元件 将复合光分解成单色光 棱镜或光栅 04 00 46 聚焦装置 透镜或凹面反射镜 将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝 出射狭缝 进入检测器 3 样品室 样品室放置各种类型的吸收池 比色皿 和相应的池架附件 吸收池主要有石英池和玻璃池两种 在紫外区须采用石英池 可见区一般用玻璃池 为什么 04 00 46 4 检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号 常用的有光电池 光电管或光电倍增管 5 结果显示记录系统将信号放大并显示出来 由检流计 数字显示 微机等仪器组成 二 类型 1 单波长单光束分光光度计 2 单波长双光束分光光度计 04 00 46 1 单波长单光束分光光度计 04 00 46 2 单波长双光束分光光度计 04 00 46 04 00 46 04 00 46 04 00 46 04 00 46 三 仪器测量误差 根据误差传递公式 可以推导出浓度测量的相对误差为 T 0 368 36 8 A 0 434 为了减少测量误差 控制溶液的吸光度 A 0 2 0 7 T 70 10 04 00 46 四 实验条件选择 1 仪器测量条件任何分光光度计都有一定的测量误差 这是由于光源不稳定 实验条件的偶然变动 读数不准确等因素造成的 这些因素对于试样的测定结果影响较大 特别是当试样浓度较大或较小时 因此 要选择适宜的吸光度范围 以使测量结果的误差尽量减小 通常将待测溶液的投射比 T 选在10 70 或吸光度 A 在0 2 0 7即可 如何实现 04 00 46 2 测量波长的选择 无干扰 选择 max 有干扰 选择要根据干扰而定 待测溶液吸光度的选择 控制 A 0 2 0 7 T 70 10 方法 选择C 浓度 选择b 液层厚度 04 00 46 3 参比液的选择 原则 扣除非待测组分的吸收 以显色反应为例进行讨论 M R M R max 试液显色剂溶剂吸光物质参比液组成 无吸收 无吸收 光学透明 溶剂 基质吸收 无吸收 吸收 不加显色剂的试液 无吸收 吸收 吸收 显色剂 基质吸收 吸收 吸收 吸收 显色剂 试液 待测组分的掩蔽剂 若欲测M R的吸收 max A 样 A 待测吸光物质 A 干扰 A 池 A 参比 A 干扰 A 池 04 00 46 4 显色反应 有机物质 官能团强吸收 直接测定 UV VIS 官能团弱吸收 衍生化反应 UV VIS 无机物质 通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定 以提高灵敏度 04 00 46 1 显色剂选择 a 显色反应灵敏度高 有较强的吸光能力 b 反应生成物组成恒定 稳定性好 c 对照性好 显色剂与有色配合物的 max差别在60nm以上 2 显色剂用量 通过实验确定 04 00 46 第十章紫外可见分光光度法 一 定性 定量分析方法二 分光光度法应用三 有机物结构确定 第四节紫外吸收光谱的应用 04 00 46 一 定性分析与定量分析法 定性分析基础 定量分析基础 物质对光的选择吸收 在一定的实验条件下 物质对光的吸收与物质的浓度成正比 04 00 46 1 定性方法 定性主要的依据 吸收光谱所具有的以下特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置 波长 吸收峰的强度相应的吸光系数 04 00 46 2 定量方法类型 单组分的定量吸光系数法 单色光很纯 在给定实验条件下由A cb计算例如 维生素B12样品2 50mg用水溶解成100ml后 盛于1cm吸收池中 在361nm测得A值为0 507 求吸光系数和含量 已知吸光系数 比吸光系数 的标示量为E 207解 E A cb 0 507 0 0025 202 8g 100ml 04 00 46 样品中B12 E 样 E 标 202 8 207 98 0 标准曲线法 单色光不纯 依据A kc测定时 配制一系列浓度不同的标准溶液 在同一条件下分别测定A 然后以A为纵坐标 浓度为横坐标绘制A c曲线 标准曲线如右图 根据样品溶液测得A值 从曲线上求得样品的浓度 该法对仪器要求不高 适合大批量样品分析 04 00 46 芦丁含量测定 04 00 46 对照法 在相同条件下 在线形范围内配制样品溶液和标准溶液 在选定波长处 分别测定吸光度 由朗伯 比尔定律求算 A样品 样品c样品b A标 标c标b因同种物质 同台仪器 相同厚度吸收池及同一波长 故 样 标 所以C样 A样 A标 C标例如 维生素B12注射液含量测定 精密吸取B12注射液2 50ml 加水稀释至10 00ml摇匀 另配制B12标准液 精密称取B12标准品25 0mg 加水溶解并稀释至1000ml 摇匀 在361nm处 用1cm吸收池分别测得样品和标准溶液的A值为0 508和0 518 求B12注射液的浓度 04 00 46 解 c样品 98 1 g ml 多组分定量多组分的定量依据 A总 Aa Ab Ac 在混合组分测定中 遇到各组分吸收光谱双向重叠 相互干扰时 可根据测定目的 要求和光谱重叠的不同情况采用下列方法 三种情况 两组分吸收光谱不重叠 互不干扰 两组分在各自 max下不重叠 分别按单组分定量 04 00 46 两组分吸收光谱部分重叠 1 测A1 b组分不干扰 可按单组分定量测Ca 如下图 2 测A2 a组分干扰 不能按单组分定量测Ca 如下图 04 00 46 04 00 46 两组分吸收光谱完全重叠 混合样品测定 a 解线性方程组法b 等吸收双波长消去法c 系数倍率法 04 00 46 a 解线性方程组法 步骤 04 00 46 b 等吸收双波长法 步骤 消除a的影响测b 04 00 46 消去b的影响测a 注 须满足两个基本条件选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大 04 00 46 c 系数倍率法 前提 干扰组分b不成峰形无等吸收点 04 00 46 步骤 b曲线上任找一点 1另一点为 2 优点 同时将待测组分和干扰组分放大信号K倍 提高了待测组分测定灵敏度 04 00 46 二 紫外可见分光光度法应用实例 1 氢键强度测定 氢键的形成能使羰基的n 跃迁吸收带发生紫移 例如丙酮在非极性溶剂己烷中n 跃迁的吸收波长为279nm 而在极性溶剂水中n 跃迁的吸收波长为264 5nm 两者跃迁的能量差正好是丙酮在水中形成氢键的强度 氢键的强度用EH表示 EH EP En