IPP使用总结.doc

重要定义1转换光密度单位的方法如下1AOI技巧（灰度值、面积测量）2编制宏4计数8图象分析策略11图片的保存13光密度13关闭相机的自动白平衡功能15免疫组化光密度测量16统计问题21宏操作22转换光密度单位 选好待测量的区域 指定测量项目 进行测量统计重要定义：把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，这部分区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI（area of interest）图片中被标上红色的区域被定义为一个class，其中每一个独立的小区块被定义为这个class中的一个object。以此图为例，图中深蓝色的部分是细胞核，因此所有的细胞核都被选中成一个class，其中每一个细胞核就是一个object在默认的intensity格式中，是图片灰度，越黑数值越小，越白数值越大。而实际上我们测量的染色强度是光密度，染色越深，光密度值越大。需要进行转换图象intensity格式，如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全是错误的。转换光密度单位的方法如下：点击：measure-carliberation-intensity，调出intensity校正窗口。然后在窗口中点new按纽，再点一下下面的std optical density选项，这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线。然后还要点一下最上面的system按纽。最后点close关闭窗口。这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位。将光密度单位设定为system之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了。AOI技巧（灰度值、面积测量）：（1）segmentation工具：面对组织切片中密密麻麻的细胞，就得用本主题讨论的segmentation工具。正确的操作顺序是：先打开select measurement，选择好各个测量项目，再回到count/size中点select color进行颜色选取，再回到count/size窗口中点count计数。这样操作结束后仔细观察一下计算的区域，正是刚才正确选取的区域了。点measure的select measurement ，选中area, density（mean），IOD。选manual，并点select color调出segmentation窗口。窗口里有两个表单，一个是color cube based，另一个是histogram based。我们要选取后者，并且使用HSI颜色格式来进行分色选择。当切换到HSI时，会弹出一个窗口提示你会reset颜色选择，是否继续？当然是OK啦。这时的颜色选择全部重置为0-255。在HSI颜色格式中，H为色调，就是我们眼睛所看到的红橙黄绿青蓝紫等。S为色饱和度，I为强度。在选择AOI时，首先保持S、I为最大范围，从H中选择黄色部分。点一下H，直方图显示就是图片各象素H值的分布，在直方图的两边各有一根线，这就是选择线，先将右边的线用鼠标左键向里面拉，拉一点停一下看看效果，可以看到最开始时是选中了全部画面，然后是蓝色的区域慢慢显露出来，并且越显越多，选择线的位置也在下面的窗口中有显示，是0-255之间的数，共有两个窗口，左边是取值下限，右边是取值上限，先不断减小上限值使得非黄色区域不断地显露出来，再不断增加下限值让另一部分非黄色的区域也显露出来。 这张照片中黄色区域为H：0-33。色饱和度S与强度I都直接设为0-255。这就是说，只要是黄色，就被认为是阳性表达的区域。过滤（去除杂质小点）：上面选取的区域还是有一点不准确。图片中被选中的区域有许多很小的选点，显然这是各种杂质，并不是成片的蛋白表达区域。对这些杂质小点有一个有效的方法来去除，就是测量过滤（filter）。 打开select measurement窗口，点一下中间被选中测量项目中的area项，使其加亮。这时下面的start与end选项就变黑可调了。对area来说，默认值一般是0，意思是不管区域有多小，都被计入测量范围内。现在我们把它改为50，也就是说，忽略了象素点小于50的杂质点，不予计算在内。改完后点一下旁边的Filter按纽，再点measure按纽，或者回到count/size窗口内把Apply Filter Ranges in Range前面的选项给勾上，再点count按纽，这回就把小杂质点全给过滤掉了。回到count/size窗口，按count纽。 凡是玩电脑都必会有一个reset键。不管作错了什么事，按一下reset键就可以全部重新来。选AOI也是这样，如果选得不合心意，想全部重新来的话，按count/size窗口中的delete键，就可以把刚才作的一切都给全部推倒重来了。（2）irregular工具：这是一个用来描绘不规则孤立对象边界的工具（细胞）。对于大个的孤立图形对象的选取是有用的。（暂时不用该工具）编制宏：宏不过是把一连串的操作集合到一个操作的有效工具。以下面的免疫组化照片的分析测量为例，处理顺序是：打开图片后1.点开count/size窗口，点measure-select measurement 菜单，选择Area、density（mean）及IOD三个测量项目，不使用测量过滤。class object 标记为标记class颜色，2.选择图片中黄色区域作为蛋白表达区，组织空白区域较亮的地方为背景区域。经试验这两个区域都用HSI分色选取比较准确。蛋白表达区的HSI分色数值为H：0-28，S与I都是0-255。背景区的HSI分色数值为H：52-140，S：0-255，I：173-255。3.先测量蛋白表达区。选完分色后点count，在statistics窗口中把统计数值传入Excel中。4.再回到segmentation中选背景区的分色，再次count，把统计数值传入Excel。测量结束时在Excel中有两组统计数值。宏操作前的准备：1.把count/size窗口中各项选择设置完成后，（包括select measurement、class option设置）点击file菜单的 save settings 将这些设置保存成一个文件，保存位置最好放在与待处理图片一起的文件夹中。并起一个有意义的文件名，但最好是英文。2.再把segmentation窗口打开，选好阳性表达区域的分色后，点击下面file中的save file，把这个分色设定也保存成一个文件，也起一个有意义的英文文件名。存完后重新选择背景的分色，再把背景分色设定也保存成一个文件。3.打开stistics窗口，如果打不开的话可先点一下count随便测量个数值。然后点一下file菜单中的DDE option窗口。设置一下测量数据传往Excel的规则，这很重要。如果设置不当，你会不知道传过去的数值跑哪里去了。在DDEoption窗口中从上到下需要填的选择是：target program：Excel 这是废话，不必改，就这样了。path： 也别改。里面是Excel程序的文件位置，好长呢，别动它。sheet：Active sheet。 这是说数据将存到Excel中活动表单中了，还有一个选择是填sheet 1 。这样统计数值每次都会存到第一页里。position data set row 1 col 1 这是指定数据从Excel表单的具体哪个位置开始放，现在的行列值都是一，就是左上角。在测量过数据后，这个行列值会自动地按下面选项的规则递增。如果想让数据重新从左上角开始填，那就必须把这个行列值给改回1。再下面是三个单选项:append next date set to the bottom 下一组数据放在前一级数据的底下。append next date set to the right 下一组数据放在前一级数据的右边。imcrement position for naxt date set by row _ col _ 这个更灵活，只要填上几行几列，下一组数据就移动几行几列存放。如果行列值都填为0，那么每次都会存在同一个地方。后面的数据会覆盖前面的数据。设定了DDE option后，不要关闭statistics窗口。让它留在那。这样DDE的设定就不会悄悄地变化了。作好上面的准备工作，就可以正式录制宏了。1.打开一张图片，打开count/size窗口，还有空着的statistics窗口。2.点Macro-record Macro，就调出来了录制宏的开始窗口。要填上Macro Name和Shortcut key。对呀，得给宏起个文件名好保存，另外还要设置一个快捷键来运行它。名字得是八个字母的英文名。快捷键可用ctrl-A之类。用与ctrl或shift位置较近的字母如ASZXWQ或OPLKM之类。按起来容易。3.然后点OK就开始录制宏操作了，一步也不能操作错哟，否则你的错误操作会被记录在案，并且在每次运行宏操作时都重复这些错误。点完OK后，宏记录的窗口停在屏幕右下角，当你记录完所有宏操作后，点其中的stop recording就记录完成了。别忘了在录制宏之前打开一个Excel空工作簿。这个示例的宏操作步骤如下：1.点count/size窗口的file-load settings 2.从弹出的文件夹选择菜单中调出刚才保存的count设定文件。3.点select color 调出segmentation窗口。4.点file-load file 调出刚才保存的阳性区域选色数值文件，然后close选色窗口。5.点count，计数，统计数据会马上显示在statistics窗口中。6.点statistics窗口中的file-DDE to Excel。7.点count/size的delete纽删掉刚才的计数。8.再点select color。9.load 背景选色数值文件。10.点count计数。11.点DDE to Excel。12.点delete.13.点stop recording结束录制宏。有两个delete动作是不是有点多余？不，它可以节省宏运行时间的。录制完宏以后。每次处理图片时任何窗口都不必打开，只要打开图片，按一下宏运行的快捷键ctrl A。只见屏幕一闪一闪地，几秒种，测量数据就在Excel里了。如果是数据顺序排列的话，不用管Excel。打开下一张图片，按ctrl A。几秒钟宏运行结束后再处理下一张。这个速度可是飞快呀。二百五十张图片一会就处理完了。五百组数据都在工作簿里，随便你怎么处理了。宏录制错了的修改：删除掉录错的然后重新录制宏。计数：最简单的数细胞的工具是measure-measurement窗口，下图中左边红线框住的工具就是计数的工具。这很象我们在镜下手工计数，认为那个地方有细胞，就在那里点一下作个标记，这样就不会重复数，也不会漏数。当图片中的细胞数目多得一眼看不出有多少个，但同时也不是多得密密麻麻的时候，比如几十个吧，用这招最简单。 好象这样计数不正规呀，最好是电脑点一下就能算出数来是最好的。那还是用count/size工具吧。这张荧光镜下照片中细胞闪闪发亮。所以选择计数测量时可以让电脑自动选取亮物体作为识别标志。点一下automatic bright objects，再点count。调出statistics窗口就可以看到自动计数结果了。可是它数得准确吗？有156个细胞？数多了吧？错误计数纠正：过滤，把错误计算进去的计数给过滤掉。图片中的细胞都有一定大小，那些只有几个像素的小绿点显然不是一个细胞。因此可以对每个object的面积大小进行过滤，小于一定面积的就不是一个细胞。调出count/size中的select measurement窗口，点一下中间filt range窗口中的area，再点一下下面的edit range按纽，调出来edit range窗口。在这个窗口里上面有一个范围选择图表，表内左右两端各有一条竖线，分别是范围选择的上限和下限，可以用鼠标拖动的，把这两条线往中间拖，就减小的选择范围。此表的横坐标数是面积的象素值，纵坐标是对应像素值面积有多少个object。图表下面有两个数值选择框，是两条选择线的具体数值，也可以在这里选择过滤数值范围。再下面是统计数据，可以动态地看到过滤后的计数统计结果。display filled是显示图片中的object标志的，如果选中此项，每个选中的object都显示成一个红巴巴，否则就只用边缘线框起来。图中可以看到，如果把面积下限定到100象素，就只剩下16个细胞了。当调整过滤数值时，图片上的object标志也会动态地显示，过滤掉的object会立即消失。分开或合并：图片中有两个细胞紧挨在一起的，被识别成一个object了。而另外还有细胞因为太暗，被识别成两个甚至更多的object了。这只能用人工把它们分开或合并。在count/size窗口的edit菜单下，上面的几个split命令就是用来分割连在一起的object的。auto split 与watershed split都是自动分割，操作简单，但很少分成准确。split是手工分割，点此后出现一个小窗口，用鼠标在相连的两个object的连接处划一条短线，将两个分开，再点一下右键就行了。把图片上所有相连的object全分割后再点一下小窗口的OK按纽。再回去count一遍，分割就生效了。limited watershed split也是手工法分割。这种分割方法是半自动的。道理有点象涨大水。两个挨着的山峰，在山脚处是相连的，如果山下涨了洪水，这两座山峰就会彻底被水隔开了。但是水涨多高才能把两个山峰隔开呢？这个limited就是让你自己掌握涨水的程度。以便分割得更准确。按照说明书的意思，需要输入的数值是涨水最多淹没多少象素的数值。有挨在一起的细胞，就有一个细胞被识别成两个以上object的。用手工将它们合并的命令是Draw/merge objects。这跟split的操作类似，只是不划线，而是画一个圈，把几个本应在一起的Objects围起来就行了。一些比较暗的细胞没有被计算进去，可见auto bright object并不灵验，还得用segmentation工具来选色呀，看看这回的计数效果吧。具体作法大家当作作业自己试试吧，我是用吸管工具来选色的，图象分析策略：？要作好免疫组化图片的数字分析，从拍摄显微镜照片时开始就要考虑操作细节了。.数码相机不能用自动调节设置，全部用手动设置。包括曝光时间、变焦、光圈。还有一个很多人都想不到的地方：自动白平衡功能要关掉。前面的照片中有几张看上去背景是浅蓝色的，这就是数码相机的自动白平衡功能在起作用。因为整个画面都是黄色的染色，相机就会认为画面色温偏低，要进行一下较正，给加点蓝色吧。浅蓝色背景其光密度与浅黄色的阳性区域差不多，这样就给准确测量光密度带来了更大的误差。举个例子来讨论一下分析策略：从直观来看这些切片图象，处理后切片整体感觉其“黄色”越来越浓。正常组织也有一点黄色的地方，而阴性对照组织则一点黄色的地方也没有。分别测量一下各个照片整体的平均光密度（density mean）。阴性 正常 一天 三天 五天 191 170 175 163 155看上去用density（mean）测量其平均密度就行，各个片子之间有差异。可是把各组切片都这么测量一下，问题就来了，别忘了每组有十来张切片，其光密度值各有不同，因此进行了统计学处理后发现，除阴性组以外，其他各组之间并无显著性差异。看来简单地测量整张图片的density mean是不行的。下一个招是测量图片中黄色区域的累积光密度（IOD）阴性组几乎没有黄色区域，IOD很小。正常组也有黄色区域，与一天组、三天组之间，IOD没有显著性差异。五天组的实在是太“黄”了，其累积光密度与其他组有显著差异了。其实图片中细胞间隙的背景也是有一定光密度的，测量一下，它的密度值与阳性区域差得还真不太大，这个密度值应该被扣去。再加一招，计算每张图片中的：阳性区域光密度值-（阳性区域中阴性部分光密度值）=阳性区域IOD-（阴性区域density mean） X （阳性区域Area）式中阳性区域IOD是照片统计数据中IOD的SUM值。阴性区域 Density mean是阴性区域density （mean）的平均值。阳性区域Area是Area的SUM值。这回各组之间的差异就表现出来了。不过这个策略是否正确，我也不敢较真。这些照片的背景是浅蓝色的，说明照片拍得还不够理想。这种扣背景的作法是否合适呢？图片的保存：这个IPP也一样，学会了初步的图片处理应用后再一点点学习里面其他用得着的功能。这时最好的学习方法就是看帮助文件，不要看中文翻译的说明书，而是看程序自带的Help。进行完图片分析处理后，IPP在图片上标记了各种object的标记，比如把选中的细胞标记上calss color，还可以在每个object上标记上object的序号或者测量的数值。这样的图片很好看，如果你想保存下这样标记上各种记号的的图片，该怎么作呢？按print screen截图是最笨的招。在工具栏上面有个照相机的按纽，点一下它，就能把当前图片的外观给新建成一个图片了。 光密度：纯黑的点的“亮度”为零。定义其灰度gray=0。纯白点的“亮度”为255。定义其灰度gray=255。光密度则是光学测量中的概念。OD值（optical density）叫光学密度，定义为吸收光线物质的光学密度，它与该物质的物理密度应该是线性相关的。OD值与透过它的光强之间的关系符合朗伯-比尔定律，是指数关系。当OD值等于0的时候，对光线无吸收，透射率100%。对应照片上最亮的部位，白色，gray=255。当OD值等于无穷大的时候，会吸收全部光线，透射率为0。对应照片上最黑的部位，gray=0在未进行intensity校正的情况下，IPP用的是gray灰度单位。浅色处灰度值大，深色处灰度值小。这样测出的density数值是染色深的阳性区域数值小，染色浅的背景区域数值大。这就带来了极大的不方便，很容易就出现错误。还有问题呢。因为光强与光密度之间是指数关系。在光密度不大的时候（阳性区域染色浅）阳性区域的density数值与背景density数值都处于较高水平，相差很小，作了减法以后误差增大，扣背景时就会出现极大的误差，而且造成统计数据的效果混乱。在未定义光密度校正的情况下，density mean与IOD的数值实际上都是照片的gray值。gray与OD值的换算公式就是朗伯-比尔定律，是指数关系。当我们使用IOD（累积光密度=area * density_mean）表达切片上阳性物总量时，如果错用了灰度值。IOD的数值与染色深浅就成了负相关，也就是染色越深，IOD反而更小，但同时，面积越大，IOD仍然越大，这个错误的IOD值就根本不能反映“照片上阳性物质总量”了。因此在作光密度分析时必须对程序系统的光密度值进行转换，从灰度数值转换为光密度数值单位。在平时，很多人并不清楚灰度与光密度之间的异同，甚至在发表的文献上也是胡乱使用这两个不同的概念。由上面的分析我们可以看出，实际上灰度是我们用电脑进行图象分析时所用的中间变量。而光密度才是我们真正需要使用的单位。我们是通过对照片的灰度进行分析来测量样品的光密度的。对于光密度的校正有两个层次：第一个层次是按照照片的灰度值直接换算。灰度为零的换算为无穷大，灰度为255的换算为0。 第二个层次是考虑到照片的实际情况，把照片最“白”的地方（灰度值小于255）定义为OD=0。这实际就是一个扣除背景的操作。相当于在分光光度计上调整“100%”点，再把照片中最“黑”的地方定义为一个大于零的值。一般定义为2.0（定义为无穷大是作不到的）。或者用标准样品的光密度点直接定义其为样品浓度的值。这相当于在分光光度计上定义零点和标准点。校正光密度的具体方法（第一、二水平）第一层水平：1.点measure - calibaration - intensity.（得先打开一张图片才行）。出现的窗口里是空的。注意窗口第四行有一段文字：no system caliberation set。2.点窗口里的new按纽，新建一个caliberation set，在下面点击std optical density。再点一下左上方的system按纽。这个system是一定要点的，否则这个光密度较正的设置就只作用于这一张图片，对其他的图片不起作用。3.点close就完事了。以后进行光密度分析时，使用的单位就是真正的optical density了。测量的光密度数值与样品浓度呈正比关系，而以前的灰度值是与样品浓度成指数关系的。第二层水平：4.进一步的校正应该是对“白”点与“黑”点进行定标。定黑点时需要有标准点。可以在切片上帖一片全黑物体，作为标准，或者是定量浓度的样品点，可指定其为浓度的单位。这一点往往作不到。不作也罢。测个相对值就是了。定白点实际上就是扣除空白、扣除背景。把图片上最浅的地方定义为OD=0每张照片上这个值都不会一样的。难道每张照片都要这么来一下吗？不必。在一组照片中，背景虽然不一样但不会差得太多，找一个最大的（最亮的）设为其公用的背景值也是可以的。点option按纽，在弹出的小窗口里有black与intensity两个设置。black就让它为零。点intensity旁边的image按纽，到图片上最“白”的地方点一下，看看值是多少，最好在一组照片的每一张最白处都点一下，看看它们的值相差多少。然后选其中最大的数值填入。OK后可以看到光密度曲线的终点由255变成了你填入的值。 关闭相机的自动白平衡功能：图中这两张照片是一模一样的吗？只有一点不同，一张是相机上设置了自动白平衡校正。另一张则关闭了这个功能。自动白平衡是数码照相机为了保持照片色彩的均衡的功能。使照片看上去不偏色。可是用染料染色的显微镜照片就偏偏都是有偏色的。它就是需要偏色的。这样数码相机的自动白平衡功能就有点多余了。当你拍摄黄色的免疫组化切片时，相机会认为照片太黄，必须增加点蓝色平衡一下。这就是一些黄色的免疫组化照片上的空白处呈现淡淡的蓝色的原因。这样照片是顺眼了一点，但是背景值的光密度却被增加了，阳性区域的光密度却被减少了。所以拍摄显微镜照片时要关闭相机的自动白平衡功能。特别是要进行光密度分析时，不能使用自动白平衡功能。自动白平衡功能对荧光照片的影响特别大。 免疫组化光密度测量：方法一（一）显微镜下拍摄免疫组化照片需要注意以下几个要点： 1.所有照片必须在完全同样的显微镜条件下拍摄，在更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。当然，在使用高倍镜时对焦及寻找视野会稍麻烦一点，但也没办法。保持各张切片的拍摄条件一致更重要。 2.数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉！ 3.免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。下面两张照片中左边一张是合适的曝光，右边那张不好。（二）校正打开要分析的图片后首先要进行光密度校正。点开intensity calibration窗口后，选std option density，并点option按纽，在弹出的窗口里点insident旁边的image按纽。弹出第三个窗口后，将鼠标移到图片的空白处点一下，就可以看到current value的值会显示出点击部位的灰度值。白色的背景能达到250左右，而拍得较暗的照片或者背景偏蓝的照片则只有200甚至更低。一张照片的背景强度不会是完全一样的。所以要在照片各个不同的空白处都点一下，看看它们的值差别大不大。许多相机拍的显微镜照片是中间稍亮，四周暗。所以最后确定的背景值只能是取它们的折中。较正背景的值会在曲线的X轴端中表现出来。 光密度校正窗口可以放在屏幕上随时检查，有时候在切换了图片后其光密度校正值会有变化。（三）选择测量项目现在可以调出count/size窗口，先选择测量项目，前面说过density mean是不合适的测量参数，IOD也有点误差，不过这是系统误差，对半定量分析的影响不大。所以可以选用IOD与area两个测量项目。当然把选中区域转换成灰度图片再测量更好。另外对option也要适当设置一下。 然后要保存count/size窗口的设置，点count/size窗口的 file - save settings，将当前的测量设置文件保存，最好与图片文件存在同一个文件夹里，免得以后找不到。文件扩展名是 .env 。保存这个文件的目的是为了制作宏操作用的。（四）选择待测量区域下面就可以选择颜色了，点select colors，取HSI颜色系统，S与I都选0到255，H选0到30左右。这基本上包括了黄色区域。然后也要保存颜色设置文件。（五）测量统计下面就可以测量光密度值了，点count，然后到statistics窗口中查看测量值。IOD SUM 与area SUM是有意义的测量值。IOD SUM是图片中黄色区域的累积光密度，area SUM则是选中的黄色区域的面积。方法二如果想要测准一点，就需要把选中区域复制下来，再转换成灰度图片后再测量光密度。作法如下：1.选好颜色区域后，在preview中选transparent on white，这时图片中未被选中的区域都被填上了白色。再点create preview image按纽，就生成了一张新图片，再用edit - convert - grey scale 8把这张图片转换成八位灰度图片。2. 重新校正光密度，依然把insitent level定为250。这实际上就是扣背景了。3.对灰度图片，select color按纽变成了select range。点出的选色窗口只有一个强度范围，要选择0到255。整个照片都选上，当然，选0到250也行，没选上的都是白色区域，测量没有影响。4.回去点count按纽，到statistics窗口里察看测量值。IOD的确与上面所作的不同。area也稍有差异，当属复制图片引入的误差。统计问题：最简单的情况是，切片充满整个视野，并没有大片空白。此时IOD值就能反映出这两张图片染色程度的不同。实际上这些照片的测量区域面积都是整张图片（不是黄色区域的面积），其平均光密度就是IOD除以图片的整个面积。实际上比较的就是整个视野的平均光密度。另一种情况是照片上有空白区域，是没有组织的空白。因此在计算平均光密度时要把这部分面积给扣掉。使用的测量指标应该是切片的平均光密度，计算方法为IOD/（照片面积-空白区域面积） 照片面积就是照片的象素，一张480*720象素的照片面积是345600。 空白区域面积得另测一下，选色时把 I 选在250-255之间，H选30-255，再count一下就能测出了。不过这样测有时会把组织内部的小空泡也选进去。这只要在面积测量中设一个大一点的过滤值就行，比如只计算面积大于200象素的区域。还可以看measurement date ,找那个最大的几个object的面积。 如果视野内还有不同类型的组织区域，不应被计算进去，可以用不规则曲线工具选中这些区域，用edit - filled 把它们填上白色。再进行测量。一句话，测量的IOD是分子的值，一般情况下都相似，选择的area这个分母在不同的切片上却各有不同，需要看切片的具体情况进行适当选择。本质上比较的指标应该是一个平均光密度（IOD/area）。宏操作：制作宏的操作：一、准备工作：1.进行光密度较正。命名保存，如system。2.在count/size窗口中设置：measurement：area（10-10000000），IOD（0-100000000）option：outline：none，label style：none .clean border：none然后点file -save setting，保存该设置为一个文件date.evn，文件位置最好是分析的图片文件夹里3.在select color 里选HIS：H