结核病的实验室诊断技术及应用ppt课件.ppt

结核病实验室诊断技术及应用 1 全球范围内结核病疫情急剧恶化全球1 3人口 约20亿 已感染了结核菌 人口的大规模流动结核病与艾滋病同时流行结核菌耐多药菌株的出现我国是世界上仅低于印度和印尼的第三结核病大国患病率高 新发患者93万 年 结核菌感染率为约40 死亡率高 每年死亡人数达13万耐药率高早期快速诊断与治疗成为制约结核病防控的关键因素常规结核病实验室检测方法诊断阳性率不到60 摘自2014年中国结核病监测报告 2 结核病检测技术发展历程 灵敏度低检测周期长成本低 交叉污染仪器要求复杂反应抑制 高灵敏度高特异性交叉污染少 血清学检测WHO不推荐r 干扰素释放实验 结核病检测技术发展历程 3 一 细菌法直接涂片 阳性率低 5000以上细菌 ml 不能区分真假 死活 4 一 细菌法结核菌的培养 结核病病原学诊断的金标准 培养时间长是其软肋 5 一 细菌学检测的新方法 提高阳性率 发光二极管荧光显微镜 LED 液体培养 可同时缩短培养时间 自动化涂片 染色技术 夹层杯法 不能区分真假 死活 培养仍是金标准但耗时长 6 分枝杆菌固体培养与液体培养比较 液体培养在提高阳性率 缩短报阳时间上均优于固体培养 吴学兵 陆彬 桂晓虹等 液体MGIT培养法在结核分枝杆菌检测中的应用评估 检验医学 2013 3 28 211 214 仍然不能满足临床快速诊断的需要 7 二 免疫学检测 血清学检测 抗体 抗原 结核菌素试验 灵敏度 特异性 结核感染T细胞检测 干扰素检测 8 WHO关于血清学检测声明 2011年7月20日 世界卫生组织 WHO 正式声明 要求禁止将血清学检测方法 抗原 抗体 蛋白芯片等 用于肺结核和肺外结核的诊断 WHOwarnsagainsttheuseofinaccuratecommercialserologicaltestsforpulmonaryandextra pulmonaryTB 蛋白质组学的发展3 4 7种结核杆菌优势表位抗原 16KD 38KD MPT64 ESAT 6 CFP10 Mtb8 Mtb8 4 Mtb16 3 制备多靶点蛋白微阵列大量的文献报道其敏感性特异性均显著高于涂片与培养法可用于结核病的临床辅助诊断 提高痰涂片和痰培养假阴性的检测率 参考文献略 9 干扰素释放实验 IGRAs 10 Interferon GammaReleaseAssays 10 结核杆菌特异抗原 ESAT 6与CFP10 由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗 BCG 均丢失RD1和RD2绝大多数的环境分枝杆菌 NTM 也不存在RD1和RD2区 11 ESAT 6 早期抗原靶6 EarlySecretedAntigenicRarget6 CFP10 培养滤液蛋白10 CultureFiltrateProtein10 11 12 结核杆菌特异抗原 ESAT 6与CFP10 12 准确 T SPOT临床诊断性能 特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感 与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗 BCG 无交叉反应美国FDA数据 特异性97 1 297 306 国内临床数据 特异性94 1 478 508 灵敏度基本不受免疫力低下 受抑制影响 在肺外结核患者中有很高的检出率美国FDA数据 灵敏度95 6 175 183 国内临床数据 灵敏度95 3 624 655 13 13 T SPOT相关指南 T SPOT TB是采用 干扰素释放试验 IGRA 原理 获得美国FDA认证 欧盟CE认证和首个中国CFDA认证的商业化产品列入欧美25个国家结核诊疗指南2011年英国NICE指南 2010年美国最新结核诊疗指南 2010年加拿大结核指南美国CDC推荐 卡介苗 BCG 接种人群结核感染检测首选国内风湿科和消化科已列入专家共识 14 14 快速 T SPOT的实验步骤 15 15 实验效果图 一个斑点 一个结核效应淋巴细胞 16 T SPOT结果的解读 阳性结果 活动性结核病 典型结核中毒症状 影像学支持 排除其他诊断MTB感染状态 典型结核中毒症状 未发现结核患病证据 潜伏性结核感染 无结核中毒症状 无其它结核患病证据陈旧性结核 无结核中毒症状 既往TB史或明确TB证据 NTM 四种 感染 高孟秋 干扰素释放试验检测结果的临床意义解读 中华结核和呼吸杂志 2014 17 T SPOT结果解读 阴性结果 除外结核感染 所用抗原为MTB特异性抗原 机体没有结核特异抗原致敏的T淋巴细胞 目前未感染结核分枝杆菌 假阴性 感染阶段不同 窗口期 少数免疫系统功能不全 基础疾病的情况 如HIV感染者 肿瘤患者 婴幼儿等特殊肺外结核 结核性脑膜炎 粟粒性结核灵敏度相对较低实验非正常操作 细胞计数不够等 高孟秋 干扰素释放试验检测结果的临床意义解读 中华结核和呼吸杂志 2014 18 T SPOT的应用 优点 使用血液标本 取样简单 可用于肺内和肺外结核检测 阴性预测值很高 可用于排除结核感染 缺点 阳性预测值约80 不能用于结核的确诊不能确定是否是肺结核 肺外 不能区分是活动性和潜伏性结核不能区分某些非结核分枝杆菌 堪萨斯 苏氏 戈登 海分枝杆菌 操作复杂 时间长 对于原发感染初期或免疫低下人群 可能存在假阴性 能否疗效监测 无大量数据 19 三 结核DNA检测技术 测序 金标准荧光定量PCR环介导恒温扩增法 LAMP 基因芯片检测鉴定技术基因XpertMTB RIF检测技术 20 1 荧光定量PCR 是应用最为广泛的TB DNA定量PCR检测方法具有灵敏度高 10CFU ml 特异性强 线性关系好 操作简单等优点 21 2 环介导恒温扩增法 LAMP 是在恒温下进行PCR扩增 因此操作更为简便 反应更加快速 65 扩增40min即可用肉眼观察结果 扩增阳性标本呈现绿色荧光 反之为阴性 是结核分枝杆菌DNA检测技术的代表 灵敏 快速 特异 简捷将会极大地推动结核病的防治工作 22 DNA检测 LAMP 结果判读 显色目测或SYBRGreenI等荧光染料 23 LAMP法和其他PCR法的比较 24 LAMP法在结核菌检测中的应用 临床试验 LAMP法和对照试剂 BD快速培养 对比结果 灵敏度 89 54 阳性结果预期值 98 13 特异性 98 93 阴性结果预期值 93 77 总符合率 95 31 25 26 JournalofClinicalMicrobiology 2010 48 10 3654 3660 通量 可同时检测16 22种常见分枝杆菌速度 6小时灵敏度 103CFU ml可自动或肉眼判读结果 3 基因芯片检测技术 26 检测全程仅需6小时 27 同时鉴定MTC与21种NTM 28 4 XpertMTB RIF检测技术 29 GeneXpert应用1 TB复合群鉴定 2 利福平耐药检测 3 WHO推荐4 Xpert MTB RIF检测试剂的阳性检出率低于人们对分子生物学诊断试剂高敏感度的预期值 1000CFU ml 30 DNA用于临床检验的不足 死菌检测呈阳性 与临床相关性差不能区分 潜伏感染 活动性感染 易交叉污染反应易受抑制 31 NASBA 国外 TMA 国外 SAT 国内 四 常见的RNA检测技术 32 SAT技术是将核酸恒温扩增和实时荧光检测相结合的一种新型RNA检测技术 TB SAT检测技术 33 TB SAT操作流程 50 l稀释液 全程2小时 会做PCR 就学的会SAT 34 TB SAT检测技术优点 35 RNA诊断技术的优势 灵敏度高 RNA DNA拷贝数与临床相关性好 区分 死活菌 减少抗生素滥用可以诊断 活动性感染 活动性感染 RNA转录活跃潜伏感染 RNA不转录不易污染 靶标和扩增产物都是RNA 36 TB SAT检测区分MTB和NTM 结核分枝杆菌复合群 MTB 人型结核分枝杆菌牛型结核分枝杆菌非洲型结核分枝杆菌 非结核分枝杆菌 NTM 研究表明 TB SAT可以区分如下NTM 堪萨斯分枝杆菌 胞内分枝杆菌 龟分枝杆菌 戈登分枝杆菌 海分枝杆菌等18种 NovelReal TimeSimultaneousAmplificationandTestingMethodToAccuratelyandRapidlyDetectMycobacteriumtuberculosisComplexJ Clin Microbiol 2012 50 3 646 DOL 10 1128 JCM 05853 11 37 活菌检测技术 可用作肺结核治疗效果评估 据文献报道 每个结核分枝杆菌含有约2000个拷贝rRNA研究表明 rRNA与结核分枝杆菌的生活力有着很好的相关性 rRNA可以反映结核分枝杆菌的死菌活菌状态研究表明 在用药治疗期内 随着结核分枝杆菌的死亡 rRNA大约在7天左右时间全部降解 而DNA含量几乎保持不变 VIVIANJONAS etal JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY Sept 1993 p 2410 2416CLAUDIOPIERSIMONI etal JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY Jan 1997 p 193 196 GABRIELLEM E ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY Sept 1994 p 1959 1965 38 免疫法常有既往感染问题 SAT更有利于治愈判断 窗口期 时间示意 相对浓度示意 抗体 RNA DNA 病原体感染前后各检测靶标的含量变化 死菌的RNA快速降解 有助治愈判断 用药治疗 DNA需要一段时间降解 RNA快速降解 39 相比DNA RNA检测能更好的体现疗效 服用利福平和氧氟沙星后 第三天和第七天DNA和RNA的滴度变化 相比DNA RNA与药物浓度变化的符合率更高 RNA检测能更好的进行疗效评估 GABRIELLEM E AssessmentofMycobacterialViabilitybyRNAAmplification ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY Sept 1994 p 1959 1965 DNA RNA 40 SAT与培养的监测结果一致 可应用于疗效评估 胡永领 刘成永 成松 应用RNA恒温扩增实时荧光检测技术观察抗结核药物的疗效 海峡药学 2015年第27卷第1期 SAT在抗结核治疗药物效果检测方面 虽不能直接作出药物敏感试验 但可以最快地直接判断所用药物的疗效 及时调整药物使用 可大大降低医疗成本和耐药产生的机会 大幅度减少医疗时间和费用 41 TB SAT检测体液 病灶组织标本的灵敏度 蔡杏珊 马品云 张院良 谭耀驹中国防痨杂志 2014 36 6 458 461 42 小结 TB SAT是国内唯一的结核分枝杆菌RNA检测产品 2小时报告结果 可以快速对开放性肺结核患者进行排查 TB SAT可以区分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌 准确鉴别出肺结核患者 中国防痨协会与结核病权威专家推崇TB SAT用于早期发现传染性肺结核 减少肺结核导致的公共卫生安全问题 43 美国CDC关于RNA检测技术在TB诊断的指南 1996 美国首个结核病的RNA检测技术通过FDA认证 配合培养法对涂阳患者进行诊断2000 美国CDC指出RNA检测技术用于TB疑似患者 涂阳 涂阴 痰液检测 DNA检测技术仅用于涂阳患者的痰液检测2009 更新关于分子诊断技术在TB实验室诊断的指南至少一个痰液样本使用分子诊断技术检测TB实验室初步诊断同时参照分子诊断和涂片的结果 44 中国结核病诊断专家共识 结核病诊断专家组 庄玉辉 万利亚潘毓瑄 成诗明赵雁林 王国治吴雪琼 万康林周林 许卫国居金良 胡忠义 专家共识 TB SAT显著提高结核分枝杆菌的阳性检出率 对早期发现传染性肺结核患者 控制结核病传染源有极其重要的意义 中国防痨协会 2012年6月 45 结核实验室检测方法中推荐SAT 胡忠义 实验结核病学 军事医学科学出版社 2014 赵雁林 结核病实验室检验规程 中国防痨协会 2015 46 五 耐多药结核病诊断现状 固液体培养 时间 生物安全等 分子生物学技术应用使快速检测耐药成为可能 MDR XDR的出现对结核病的防控提出了严峻的考验 47 结核耐药分子诊断技术 测序 金标准 检测突变的理想方法 实时荧光PCR探针溶解曲线法实时PCR技术 GeneXpert 线性探针杂交 HainLPA 基因芯片 Genechip 检测已知的突变位点 耐药分子诊断检测的灵敏度 103CFU ml 48 结核病耐药与基因 64 68 rpsL基因突变 70 embB基因突变 70 65 耐药基因 93 95 95 rpoB基因突变 利福平 异烟肼 50 70 katG基因突变5 10 inhA基因突变6 13 ahpC基因启动子区域突变 链霉素 乙胺丁醇 多数研究报告提示 耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关 总体上是基因一个或几个核苷酸突变 表现增加 缺失 替代 造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列 影响药物与靶位酶结合产生耐药 49 结核耐药分子诊断技术 测序 与标准序列进行比照检测未知的突变位点 金标准