20 生物化学实验--磷钨酸-镁沉淀法测定血清高密度脂蛋白胆固醇含量.doc

磷钨酸 - 镁沉淀法测定血清高密度脂蛋白胆固醇含量 【目的】 1 掌握磷钨酸 - 镁沉淀法测定血清高密度脂蛋白胆固醇含量的实验原理及操作方法。 2 了解测定血清高密度脂蛋白胆固醇含量的临床意义。 【原理】 血清中的脂蛋白可与聚阴离子及二价金属离子形成不溶性复合物，这种复合物形成的难易程度与脂蛋白分子中蛋白质 / 脂类的比例有关，比值愈小、脂类含量愈高的脂蛋白愈易沉淀，选择适当浓度的磷钨酸钠 - 镁溶液可将 CM 、 VLDL 和 LDL 沉淀，离心后上清液中仅存有 HDL ，用 “ 邻苯二甲醛 - 乙酸 - 硫酸 ” 显色法与同样处理过胆固醇标准液进行比色后，求得血清中 HDL-ch 的含量。 【器材】 1 722 型分光光度计 2 离心机和离心管 3 中号试管 4 刻度吸量管 5 微量移液器 【试剂】 1 磷钨酸钠 - 镁溶液 称取磷钨酸 4g 溶于 50ml 蒸馏水中，然后加入 1mol/LNaOH16ml ，混匀后再加蒸馏水至 100ml ，调至 pH 为 7.6 。取此液 40ml ，加 2mol/LMgCl 2 10ml ，加入生理盐水至 100ml 。 2 邻苯二甲醛溶液 （ 1 ） 储存液（ 0.1g /dl ）：称取邻苯二甲醛 100mg 溶于 100ml 冰乙酸中，置棕色瓶内保存。 （ 2 ） 应用液（ 5mg/dl ）：取储存液 50ml 加无水乙醇及乙酸乙酯各 20ml ，混匀后加冰乙酸至 1000ml 。置棕色瓶内。 3 浓硫酸（ AR ） 4 生理盐水 5 胆固醇标准液（ 40mg/dl ） 称取胆固醇 40mg 溶于 100ml 冰乙酸中。 【操作】 1 HDL 的分离 取离心管 1 支（ 9 70mm ），加入 0.2ml 血清及 0.05ml 磷钨酸钠 - 镁溶液，混匀后于室温放置 10 分钟， 2500r/min 离心 10 分钟，此时 CM 、 LDL 、 VLDL 被沉淀，而上清液中只含有 HDL 。 2 HDL-ch 含量的测定 取试管 3 支，标明空白管、标准管及测定管，按下表操作。 试剂（ ml ） 空白管 标准管 测定管 含 HDL 的上清液 - - 0.05 胆固醇标准液 - 0 05 - 生理盐水 0 05 - - 邻苯二甲醛溶液 2 5 2 5 2 5 浓硫酸 1 5 1 5 1 5 将各管液混匀后，于 550nm 波长处，以空白管调 0 ，进行比色，分别读取并记录各管吸光度值。 【计算】 血清 HDL-ch （ mg/dl ） 血清 HDL-ch （ mmol/L ） 正常值： 45 90mg/dl 或 1.17 2.33mmol/L 【注意事项】 1 离心所得上清液必须清亮透明，不能混有细微沉淀颗粒，否则需要重新离心。 2 加浓硫酸时需将试管斜置，沿管壁加入，注意安全。 3 显色稳定时间在 1 小时左右，所以要控制好实验时间。 4 本法测定正常值为 45 90mg/dl 或 1.17 2.33mmol/L 。 【思考题】 1 磷钨酸 - 镁沉淀法测定血清 HDL-ch 含量的实验