翻译-Genetic control of rice plant architecture under domestication.doc

Genetic control of rice plant architecture under domestication驯化条件下基因对水稻株型的控制与野生稻关系最亲密的普通野生稻（Oryza rupogon）被认为是栽培稻的祖先。从典型的野生型水稻株型向栽培稻株型的过渡是驯化过程中最重大的事件之一，然而这个关键驯化转变的分子基础却没有被阐明。本文陈述PROG1基因对野生稻株型的控制，包括分蘖角度以及分蘖数。PROG1定位于7号染色体上，该基因编码一个新确定的有转录活性的核内锌指转录因子。PROG1主要在形成腋芽的腋生分生组织中表达。水稻转化实验表明对驯化过程中PROG1蛋白的单个氨基酸取代的选择可导致野生稻株型向驯化型转变。水稻是重要的粮食作物，它能为超过1/3的世界总人口提供碳水化合物，并广泛的种植于全世界适于种植的土地上。栽培稻被认为是从分布于东南亚至印度的野生稻的近亲Oryza rupogon经过长期的驯化而来。通过驯化，一些重要的性状都被人选择了，如脱粒性、颜色的丧失，籽粒外形、水稻株型的改变。最近，为了研究水稻进化过程，Sh4和qSH1两个水稻脱粒性相关基因已经被定位和克隆。O. Rupogon表现出一种匍匐生长习性，它矮小但分蘖多而分散(Supplementary Fig. 1 online)。这种株型由于叶片相互遮蔽使得光合效率降低，因而不能密植。这种不受欢迎的株型经过古代人连续不断的反向选择，最终逐渐形成了株型让人满意的驯化稻(O. sativa)。驯化稻相对直立（分蘖角度小）且分蘖少，这是允许人们进行有效的高产栽培。因此，株型选择是水稻驯化过程中的一个关键事件。然而，分子基础上的选择还尚不清楚。我们通过标记辅助选择 (MAS)，用源于Te qing(O. sativa L. ssp. indica variety)作轮回亲本、野生稻(O. rupogon) 作供体亲本（来自海南）的回交后代建立了一套染色体片段代换系(CSSLs)。我们发现CSSL68携带有野生稻7号染色体短臂上的一段片段。CSSL68的株型与野生稻相同，如匍匐生长（分蘖角度大）、分蘖多。CSSL68 和Teqing的杂交F1代株型也与野生稻相同，192个F2个体有47个表现出亲本Teqing的株型(3:1 ratio; x2 = 0.03; P 0.90)。这些孟德尔遗传方式表明野生稻株型由单显性基因控制。我们把这个基因定位在7号染色体短臂上，并命名为PROG1 (PROSTRATE GROWTH 1：倒伏生长基因1)。Fig. 1Teqing 和NIL(PROG1)的株型特征。(ac) 早苗期 (a)、苗期 (b)、分蘖期 (c) Teqing 和NIL(PROG1)的分蘖数和分蘖角度的对比。箭头指向的是NIL(PROG1) 植株正在形成的蘖芽。(d,e) 抽穗期(d)Teqing 和NIL(PROG1)的分蘖数和分蘖角度的对比，以及分蘖期分蘖角度数量性状的对比(e, n = 12)。分蘖角度是左右两侧最外侧分蘖之间的夹角。用Students t-test精心统计分析发现Teqing 和 NIL(PROG1)之间的分蘖角度有显著差异。(f) Teqing 和 NIL(PROG1)生长发育过程中分蘖数的变化。Data are presented as means s.d.Fig. 1我们还建立了一个包含很短一段野生稻PROG1染色体片段的具有Teqing遗传背景和株型 (Fig. 1)的近等基因系NIL（(PROG1）。 在早苗期，NIL(PROG1)蘖芽的形成以及分蘖的形成都要比Teqing 早 (Fig. 1a,b)。分蘖期之后NIL(PROG1)会产生很多分蘖，而Teqing 产生的分蘖数则非常少 (Fig. 1c,d,f)。此外，NIL(PROG1)的分蘖角度会增大，而Teqing 分蘖角度小 (Fig. 1c,e)而表现的株型紧凑。这些结果都说明NIL(PROG1) 具有与野生稻相同的株型，包括匍匐生长（分蘖角度大）、分蘖多，这表明PROG1可能是水稻株型形成的一个主要驯化基因。Fig. 2PROG1的遗传作图克隆以及遗传互补实验。(a)用1335 个F2 代植株 (BC3F2)对PROG1作图。(b)上： 为精细定位（ne mapping） PROG1用3051 个F2代植株 (BC3F2)进行的大规模连锁分析。横线下面的数值表示PROG1与个标记之间的重组子数。下：将来自野生型水稻的携带有PROG1基因的一个2.677-kb 的DNA片段插入载体 pCAMIA1301 以产生转化载体 p1301-PROG1 。(c,d)PROG1基因的补充实验。T2转基因株系（T2 transgenic lines）分蘖期的株型 (c) 和分蘖数 (d) 携带有野生型水稻DNA片段的p1301-PROG1 vector被转化进了 Zhonghua 11。Data are presented as means s.d.。(n = 11).Fig. 2为了克隆PROG1基因，我们进行了大规模连锁分析，最终将其定位于S3204 和P71标记之间的一个14-kb 区域中(Fig. 2a,b)。在这个区域，只有一个predicted ORF被确定，它被认为是PROG1的很好的候选基因。为了确定该候选基因是否就是PROG1，我们做了遗传互补测验。 Teqing愈伤组织已经不能再生长出芽尖，因此我们选择了Zhonghua 11（O. sativa subsp. Japonica variety ）进行转化因为该品种易于再生。包含PROG1启动子以及整个ORF的2.677-kb的野生稻DNA片段被转入Zhonghua 11 (Fig. 2b,c)。我们得到了21个包含野生型DNA片段的独立的转基因株系（independent transgenic lines）。这21个independent transgenic lines都有野生稻匍匐生长、分蘖多的株型 (Fig. 2c,d)。这些结果证明该候选基因就是控制野生稻株型的PROG1。我们predicted PROG1编码包含C2H2-type锌指结构的一个功能未知的167-个残基多肽 (Fig. 3a)。最近，控制分蘖角度而不控制分蘖数的基因已经被识别，包括LA1和TAC1两个禾本科植物特种基因。PROG1以及LA1和TAC1两个基因将受到研究控制水稻分蘖角度分子机制的科研人员的重视。Fig. 3PROG1基因结构以及突变体分析。(a)锌指域的氨基酸序列图。Identical residues 都被有色的框来标注。星号*标示的是C2H2-type 锌指域的半胱氨酸和组氨酸。(b)Teqing与6个野生稻（M1M6）之间 2.679-kb 序列的对比。其中2个突变定位与PROG1的ORF，4个定位于启动子区域。5个突变只有1-bp 的替换，M4突变体PROG1基因的启动子区域则有2-bp 的缺失。(ce)T2 transgenic lines中M5、M6型突变体的株型。 从 Teqing到野生稻的包含M5 (d)和M6(e) 的双位点突变体以及被建立，并被转入Zhonghua 11。(f) 13个水稻品种（6种籼稻、7种粳稻）与3个O. Rupogon在6个突变位点的序列。Fig. 3对比Teqing和野生稻包含PROG1启动子以及ORF的2.749KB长序列，显示了六种突变。其中发现了ORF的2种碱基替换，包括并M5这种未造成氨基酸变异的一碱基替换，以及另一种在Teqing中发生单碱基替换的M6，由丝氨酸代替了原来在野生稻中的苏氨酸T152S。其他四种突变，包括三种单碱基替换突变（M1、M2、M3）和发生在Teqing中在PROG1启动子的双碱基插入突变（M4）。我们后来完成了水稻转化实验来检测这两种突变的作用。我们构建了包括了M5、M6两种替换的2种定点突变。我们分别将Teqing的M5、M6位点的G和T改变为野生稻的A(Fig. 3b)。这些突变我们将其转化入了zhuonghua11。我们获得了21种带有M5和25种带有M6的独立转基因株系。但是所有M6表现出野生稻株型，但没有一个M5表现出与野生稻相似的株型。这些结果说明了PROG1蛋白上M6位点的苏氨酸Thr152对野生稻株型起到重要作用。M5转基因株系的表型毫无变化，事实上其碱基突变并无造成ORF上的氨基酸改变。为了评估这六种突变的进化方向，我们分析了13种水稻变种，包括6种籼稻和7种粳稻还有3种额外的野生稻(Fig. 3f)。我们发现所有的水稻变种在ORF都有相同的M5及M6序列，而野生稻没有。M5突变是没有功能的，因此我们认为在M6位点氨基酸替换（功能性突变）是在获得满意株型的驯化过程中人为选择的目标。另外，所有13种水稻变种在启动子都有M1、M4突变序列，而野生稻没有(Fig. 3f)。然而,剩下两种在启动子区域的突变位点M2、M3，在这些水稻变种中检测到序列多态性(Fig. 3f)，即有些栽培稻和野生稻中都有相同的序列。蛋白序列分析证明PROG1在N-末端包含一个单一高度保守的C2H2-type型锌指结构域(Fig. 3a)，表明PROG1是一个转录子。文献检索表明除了锌指结构域，PROG1与水稻或其他生物的蛋白都不相同，这表明PROG1是一个新的锌指蛋白。为了搞清楚PROG1是否是转录因子，我们进行了亚细胞局部实验和转录活性实验。洋葱表皮细胞的短暂表达实验表明GFP-PROG1 (PROG1 from wild rice) 局限于核内(Fig. 4a)，这说明PROG1是一个核内转录因子。转录活性实验表明酵母中PROG1 (wild rice) and BD (GAL4 binding domain) 结合蛋白导致high reporter gene expression (Fig. 4b)，表明PROG1有很强的转录活性。野生稻与Teqing的PROG1的活性水平（activation levels）并没有不同，表明M6位点的氨基酸替换并不会影响转录活性，但可能会影响PROG1蛋白与其他蛋白之间的相互作用。此外，为了弄清楚PROG1的转录活性域我们进行了缺失分析（deletion analysis ）。N-末端1-69个氨基酸之间的缺失仍然有相对较高的转录活性，而C-末端的70-167个氨基酸之间的缺失则是活性大大降低(Fig. 4b),这表明C末端对于PROG1德转录活性来说是必须的。总的来说，PROG1是有活性的转录因子，且它的活性区域在C末端。逆转录PCR (RT-PCR)分析表明PROG1 基因在NIL(PROG1) 和 Teqing中的表达能被检测到，PROG1在基部节间产生蘖芽的地方表达，但NIL(PROG1) 的表达水平要高于Teqing (Fig. 4c)。实时PCR（real-time PCR）的数据更表明这一点(Supplementary Fig. 2 online)。另一方面，NIL(PROG1) 和 Teqing 的成熟叶片和根中PROG1的表达非常低(SupplementaryFig. 3 online)。这些结果暗示启动子区域的突变可能不影响PROG1转录的mRNA的立体结构，但可能会改变基部节间mRNA表达的数量。早前报道过另一个水稻驯化相关的sh4基因，sh4基因启动子区域的突变会影响其表达的量变，它在野生稻中的表达要高于栽培稻，然而sh4蛋白的一个氨基酸的替代主要导致谷粒的脱粒性。在我们的研究中，PROG1基因表达的数量差异可能是该基因对株型细小调整的选择结果。进一步对多种野生稻和栽培稻PROG1基因表达的比较进行研究，将会得到关于驯化过程中理想株型遗传基础的更深见解。为了测定PROG1基因的表达方式，我们进行了一个RNA原位杂交试验(Fig. 4df)。我们发现PROG1的克隆在腋生分生组织(腋芽形成的位置)、顶端分生组织(SAM) 以及生长中的叶片(幼叶) 中显著地积累(Fig. 4d)。PROG1在整个蘖芽中都保持强烈的表达(Fig. 4e)。PROG1基因的这种表达方式与它在控制株型上是一致的。早前已经克隆驯化相关基因，并且找到在玉米和番茄驯化过程中携带有显著形态改良的调节基因的突变体。Teosinte branched1 (tb1)被认为是玉米株型驯化改良过程中的一个关键基因。tb1基因调控区域的改变，而不是编码区的改变，会使wild Mexican grass (teosinte)驯化变成玉米。这里我们认为PROG1是参与调控水稻株型的一个关键基因。驯化过程中PROG1基因编码区域的改变使得水稻从野生型向栽培型转变。对PROG1基因的遗传作图和分子鉴定不仅给研究植物的发展、演化带来了希望，同样也给通过分子设计来优化株型以及未来育种提高谷物产量提供了机会。METHODSPlant materials.我们通过标记辅助选择 (MAS)，用源于Te qing(O. sativa L. ssp. indica variety)作轮回亲本、野生稻(O. rupogon) 作供体亲本（来自海南）的回交后代建立了一套染色体片段代换系(CSSLs)。我们用CSSL (No. 68) 与Teqing 回交得到了 F1代株系。F1自交产生的大量F2用于ne mapping。具有Teqing的遗传背景的NIL(PROG1)来自于