第02章 病毒的分类与命名.doc

第十章 杆状病毒科（Baculoviridae）一、 概 述二、 杆状病毒的基因组结构与功能（一）同源序列区（二）重叠转录物（三）早期转录物（四）晚期转录物（五）基因重组三、病毒蛋白及功能四、 状病毒感染的分子机理五、 重组杆状病毒表达外源基因六、 杆状病毒作为杀虫剂的应用主要参考文献一、概 述能够感染昆虫的病毒大约有1200种，它们主要分属于以下四个病毒科：杆状病毒科（Baculoviridae）、呼肠孤病毒科（Reoviridae）、虹彩病毒科（Iridoviridae）和痘病毒科（Poxviridae）。其中杆状病毒科病毒为数最多，大约有610种，主要感染鳞翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）和膜翅目（Hymenoptera）昆虫。由于杆状病毒具有高度专一的宿主范围，某些昆虫被感染后可发生大规模的流行病，但对人、畜和其他动植物无害，加之病毒粒子包含在蛋白晶体内，在细胞外环境中十分稳定，故可以作为一种生物杀虫剂用于农业害虫防治，目前已有成功应用的实例；由于多角体蛋白的高水平表达，其基因区段可以用来构建重组病毒以高效表达外源基因。因此，有关杆状病毒的分子生物学，倍受广大生命科学工作者的关注。1分类现状杆状病毒可以分为A、B、C三个亚组（Matthews 1982）。A亚组：核型多角体病毒（Nuclear polyhedrosis virus, NPV），在单一核内蛋白晶体中包藏有许多毒粒。根据其核壳聚集的程度又可分为单一的（SNPV）和多个的（MNPV）。B亚组：颗粒体病毒（Granulosis virus, GV），在一般情况下，在蛋白晶体中只包藏有一个毒粒。C亚组： 非包含体杆状核型病毒（Non-Concluded baculovirus），如椰二疣独角仙病毒（Oryctes rhinoceros），无包含体，可能缺少编码晶体蛋白的基因。2形态结构杆状病毒的基本毒粒为杆状，本科病毒命名即来自于拉丁字Baculum。毒粒有囊膜，囊膜中含有丰富的类脂质，并有蛋白酶。囊膜内含有一个或多个杆状的核衣壳，核衣壳中含有病毒基因组。杆状病毒基因组为双链、环状DNA分子，低密度超螺旋。有时基因组呈多个串状，病毒DNA约40m长，大约88160kb，相当于大约80个非重叠基因。病毒DNA与一种碱性蛋白密切连结，这种DNA蛋白被绊缠在一个蛋白鞘内，其核心宽约32nm，长约350nm，蛋白鞘约4nm，环绕核心形成一个稀疏的壳。核衣壳含有4.5nm直径的亚单位，排列成一个开放堆积的环形结构。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV）是A亚组的代表种，研究得最为详细。它有较广的宿主范围，能感染30种鳞翅目昆虫。有关杆状病毒分子生物学的研究，大多以AcMNPV为模型。NPV和GV的病毒颗粒有两种形式，一种是病毒颗粒被包藏在蛋白晶体内形成包涵体，包涵体的基质是由一种单一蛋白组成，在NPV称为多角体（Polyhedron），在GV则称为颗粒体。多角体和颗粒体在结构上和功能上密切相关，有时这两种名称可以互用。这种多角体可以保护病毒颗粒，使其在土壤中可以存活许多年。这一小体直径约15，可以在显微镜下看到。包涵体非常稳定，对细菌、热和许多化学物质包括低pH有抵抗，它可溶于硫酸钠中。在pH10时，它可被毒粒携带的蛋白酶所降解，这接近于宿主中肠的pH值。因此，毒粒可被释放，能够重新开始新的感染。这种病毒颗粒称为包涵体病毒颗粒（Concluded virus particles, CVP）或称为多角体释放出来的病毒（Polyhedron-derived viruses, PDV）。另一种病毒颗粒形式则不然，它在胞浆装配、芽生，进入血淋巴感染其它细胞。这种病毒颗粒称为胞外病毒颗粒（Extracellular virus particles, ECV）或称细胞膜芽生的病毒（Cellreleased virus, CRV）。在感染过程中所产生的这两类病毒，在结构、生化和抗原性上彼此不同，最明显的是在CRV有主要糖蛋白，而PDV则没有。这种糖蛋白可引起两种类型病毒在抗原性、组织嗜性和感染性方面的差异。二、杆状病毒的基因组结构与功能杆状病毒的基因组为双链、环状低密度超螺旋DNA，大小80160kb。其中研究得比较详细的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。A、B、C组的DNA酶切图谱是不相同的。AcNPV DNA的酶切图谱如图10-1所示。Sma I酶切主要有4个片段，BamH I酶切主要有7个片段；Sst I酶切主要有9个片段；Xho I酶切主要有13个片段；EcoR I酶切主要有24个片段；Hind 酶切主要有25个片段。因DNA是环状，习惯上以EcoR I片段的起点作为线状的0点来表示。图10-1. AcNPV DNA的酶切图（引自Adang M.,J.et al.,1982）AcNPV基因组的转录大致分为立即早期（，感染后2小时），早期（，感染后6小时），晚期（，感染后1012小时）和晚晚期（，感染后15小时和以上）。除期外，、期均需前一期表达的特定蛋白。迄今未发现明显的RNA剪接现象，与痘苗病毒相似，说明其基因组是连续的，无内含子。常出现重叠的RNA转录物。这些RNA具有共同的5-端，或共同的3-端。另一个有趣的特点是，在AcNPV基因组中，发现有5个同源序列区，称为同源序列区 (Homologous regions，hrs)。这些hrs富有EcoR I切点，所以，其基因组用EcoR I消化后，在凝胶中常出现大量较小的条带，大小在72215bp。在其它杆状病毒，如枞色卷蛾核型多角体病毒（Choristoneura fumiferana nuclear polyhedrosis virus, CfNPV）、黄杉毒蛾核型多角体病毒（Orgyia pseudotsugata nuclear polyhedrosis virus, OpNPV）也有类似的hrs，这说明这种同源序列区在杆状病毒中有一定的共性，但其确切的生物学意义尚不清楚。（一）同源序列区由图10-2可以看出，hr15并不集中在AcMNPV基因组的一个特定区段，而是分散在全基因组的不同区段上。DNA序列分析表明，hr1位于EcoR I片段（Pst I D）内，含4个EcoR I片段，分别为290bp，80bp，158bp；hr2位于Hind III-L片段内，含7个EcoR I片段，分别为87bp, 89bp, 90bp, 108bp, 115bp, 138bp, 161bp；hr3位于Hind B片段内，有7个EcoR I片段，分别为4 72bp,88bp,111bp,148bp；hr4位于BglG片段内，其中1个EcoR I片段（120bp）位于EcoR I-Q和L内（图10-2B中hr4左侧），另3个EcoR I片段（79bp,90bp,215bp）位于EcoR I-L和E内（图10-2B中hr4右侧）；hr5位于Hind Q片段中，含有5个EcoR I片段，分别为77bp,90bp,104bp,106bp,107bp。在hr15的保守序列区彼此有88%的同源性；在同一hr区段内，EcoR I小片段之间的重复序列中也有高度的同源性，hr1，2，3的EcoR I小片段有80%的同源性，hr4的EcoR I小片段有65%，hr5的EcoR I小片段有87%的同源性。一般来说，在EcoR I切点周围区的序列最保守，远离的EcoR I切点的序列较不保守。图10-2. AcNPV基因组中hrs的位置（引自Guarino et al.,1986）A：hrs在EcoRI酶切图上的位置，以重黑纵线15表示，纵线以下为克隆的区段。C为ClaI; H为HinfI; Ss为SspI; N为NsiI; X为XbaI; Sa为SalI。B：hr15的EcoRI切点，酶切点之间的数字表示EcoRI片段的大小(bp)。 在EcoR I切点周围60bp是高度保守区，由12155bp的非同源区序列隔开。在hr区段内，不论是保守序列，还是非保守序列，A+T均极为丰富，平均可达67%，而病毒基因组的A+T仅为58%。保守区中有28bp不完全的反向重复区（回文结构），最为保守。如图103所示，EcoR I切点为此回文序列的核心，在4个区段的保守的回文结构中只有一个bp不匹配。在hr5有2bp不匹配。图10-3. 在hrDNA中高度保守的回文序列（引自Guarino et al., 1986） *指不匹配的bp杆状病毒的hr序列具有增强子效应，如表10-1所示。如在质粒p39CAT的39K启动了上游不同方向插入hr区段，其下游的cat基因的表达明显增加，而且hr4的一个EcoR I小片段与整个hr区段一样，具有同样效力的增强作用。这说明AcNPV hr增强子和其它增强子有相似之处，即均有重复序列，但是后者并不是增强效应所必需的。AcNPV hr增强子在病毒基因组中所处的位置，明显地不同于脊椎动物病毒的增强子，后者位于主要的立即早期基因的几百个bp内，其功能是先顺式（Cis）激活调节基因的转录，然后再经反式作用（Trans）于晚早期基因的转录，然而AcNPV的hr增强子分散位于病毒的全基因组，距离立即早期调节基因IE-1至少有3kb远。IE-1的转录不为其所连接的hr5序列所影响，而其晚早期基因的表达却增强1 000倍。鉴于SV40和多瘤病毒的增强序列也是DNA的复制起始点，所以，推测AcNPV可能也有此功能。表10-1 AcNPV hr序列对CAT基因的增强效应*转录质粒 CAT活性(pmol/min/Mega细胞) 增强倍数 39CAT 1.2 139CAT-hr1+ 1 173 97839CAT-hr- 2 075 1 72939CAT-hr2+ 1 306 1 08839CAT-hr2- 2 352 1 96039CAT-hr3+ 347 28939CAT-hr3- 243 20239CAT-hr4左- 1 622 1 35139CAT-hr5+ 1 272 1 06039CAT-hr5- 1 259 1 049*g的上述质粒和0.1g的pIE-1质粒转染草地贪夜蛾细胞（Spodoptera frugiperda），24小时后收集细胞测定CAT活性。实验重复3次（引自Guarino et al.,1986）。（二）重叠转录物杆状病毒基因组转录的另一特点是带有一套重叠的RNA转录物，其数量远远多于蛋白的数量。重叠转录物不仅发生在早期转录，也发生在晚期转录。这种重叠的转录物或有共同的5-端，或有共同的3-端；如AcNPV物理图32.641.0处的重叠转录物具有共同的3-端；Hind K-Q片段的重叠转录物也具有共同的3-端；Hind Q-P的p10编码至少有4个转录物，即1.5kb，1.1kb，0.75kb和2.5kb均具有共同的5-端。在AcNPV的81.285.0物理图单位区段（EcoR I N-J）至少有9个病毒RNA，大小为1.34.6kb，具有共同的3-端，如图10-4所示。图10-4. AcNPV EcoR I N-J区段的重叠转录物（引自 Oellig C et al., 1987）（三）早期转录采用克隆的基因片段进行DNARNA杂交试验表明，在AcNPV感染秋粘虫（草地贪夜蛾）细胞系1PLBSF21 4小时后，就可发现12个主要的和30个次要的转录物。在68小时后，病毒特异性的转录物在数量上和程度上均有明显增加（图10-5）。图10-5. AcNPV早期转录物的位置、大小和数量图中虚线至重黑线分别代表RNA-DNA杂交的程度：非常弱、弱、中等、强。数字代表转录的大小（KDAb）。N.T.表示未测定。（引自Erlandson et al., 1985）（四）晚期转录物采用AcNPV的cDNA克隆选出的晚期转录物翻译的蛋白如图10-6所示。图中值得详细介绍的晚期蛋白有二个。一种多角体蛋白，相当于图中EcoR I片段内的32kDa蛋白，另一个是p10蛋白，相当于图中EcoR I P片段中的7.2kDa蛋白。图10-6. AcNPV晚期蛋白示意图（引自Adang et al., 1982）结果来自克隆的cDNA选出的晚期RNA翻译物1. 多角体蛋白在杆状病毒中，多角体蛋白具有特殊的重要性，其表达量极高，它占受感染昆虫全部碱性蛋白的17%。它由单拷贝基因编码，无内含子，其结构基因的侧翼区有高度保守的12nt，即AATAAGTATTTT，位于多角体蛋白起始密码上游2070nt处。12nt保守序列上游100nt的A+T%为47%65%，而下游则高达75%89%。测定了7个多角体和两个p10基因的侧翼区，其保守序列如下： T5 T5 T7A7 A T A A G G2 A A3 T A2 TT2 A1 C1C1其中字角数字表示相同序列的基因数，未表出数字者表示有9个基因均相同。该12nt保守序列出现在两个晚期mRNA起始点附近，其详细功能尚不清楚，可能具有启动子功能。这一12个核苷酸保守区的变异可以影响其转录水平。此外，在AUG附近位置也相当保守，在-3位均为A，这也与高效表达有关。 U4 A4 C4 A A3 C3 A U G G2 C2 T2 U2 A1OpMNPV多角体mRNA的3-端有AATACA序列，OpMNPV p10 mRNA的3-端也有类似的AATAA序列，这与其它真核的加工信号相类似。多角体蛋白有243246个氨基酸，而颗粒体蛋白为247248个氨基酸，分子量为28 66529 318。4种NPV、两种GV的多角体或颗粒体蛋白基因的全序列见图10-7、图10-8，蛋白质序列见图10-9。可见N端序列变异较大。LdMNPV在第9、10位缺2个氨基酸；PbGV在175位缺一个氨基酸；GmMNPV缺4个、LdMNPV缺6个氨基酸（另一篇报告不缺）。图10-7. AcMNPV多角体基因的全序列及推导的氨基酸序列（引自Hooft et al.,1983）-58位为转录起始，-78区、-110区各为TATA和CAAT区段，-128和-142位有两个8bp的串联重复 图10-8. 6个多角体和颗粒体基因的全序列 AcMNPV：苜缩银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californi NPV） BmMNPV：家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori NPV） OpMNPV：黄杉毒蛾核型多角体病毒（Orgyia pseudotsugata NPV） PbGV：甘兰菜粉蝶颗粒体病毒（Pieris brassicae GV） TnGV：甘兰尺蠖（粉纹夜蛾）颗粒体病毒（Trichoplusia ni NPV） (引自Rohrmann et al.,1986)图10-9. 多角体和颗粒体蛋白序列（引自Rohrmann et al.,1986） X: Glu或Gln; Z: Asp或Asn。GmMNPV: 大蜡螟核型多角体病毒（Galleria mellonella NPV） LdMNPV: 舞毒蛾核型多角体病毒（Lymantria diopar NPV）其它同图10-7。 在氨基酸序列中脯氨酸是相当保守的，在60位以后的序列中13/17保守。135位的Cys是保守的，181位的Cys也是保守的。但在颗粒蛋白中Cys在185位。酸性（Asp和Gln）和碱性（Arg和Lys）氨基酸各有15%。多角体蛋白和颗粒体蛋白的二级结构预测见图10-10，有7个保守-螺旋区（A-G）。多角体蛋白与颗粒体蛋白在二级结构上有某些不同：4个多角体蛋白中，-螺旋40%48%；摺叠为33%36%；-回转5%8%，随机卷曲13%15%；而在颗粒体蛋白中，螺旋为55%，摺叠为9%11%，回转为11%13%，随机卷曲为23%。在保守的Cys和135的Pro附近的回转区这两种蛋白都高度保守。图10-10. 多角体蛋白质二级结构预测（引自Rohrmann et al.,1986）H：螺旋。E：折叠。T：回转。C：随机缠卷。虚点代表与AcMNPV相同。 有7个螺旋区，由线条框出，并以AG表示之。 在蛋白的疏水区和亲水区也相当保守，40位、220位是两个高度保守的亲水区，在40位区域有较强的抗原决定簇。 虽然多角体蛋白和颗粒体蛋白氨基酸序列有50%的差异，但它们的三维结构是高度保守的。2. p10蛋白p10蛋白过去称为7.5KDA、7.2KDA、8KDA、10KDA。它是一种糖蛋白。p10蛋白的表达量也是十分高的，其基因位于EcoRI P片段内。p10有93个氨基酸，其分子量为10 132D。UAA位于+255位。p10多肽中无Met、His、Trp、Tys和Cys。TAU前100bp内A+T%为83%，而编码区为58%。有两组重复序列，一是在ATG上游，GCATAAACTC，相似的序列GCACAAACT也出现在多角体蛋白基因的启动子区域。mRNA起始于-64位。推测TATAAT序列位于-86位。CAATAT序列位于-160位（图1011）。p10蛋白的功能尚不清楚，可能与包含体有关。图10-11. p10蛋白基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列-64位箭头表示转录起始。ATG前标出7bp的反转重复序列，AATAAA（=处）表示聚(A)信号，（=）（）表示两组重复序列（引自KDAuzio et al.,1984）。3. p39p39蛋白是AcNPV的主要衣壳蛋白，位于56.658.0基因图单位。转录始始区有A/GTAAG序列（Thiem et al., 1989a）。其86120位与人轮状病毒VP6有同源序列（Both et al.,1984）。4. p6.9p6.9是一种碱性核蛋白，富有Arg（Wilson et al., 1987）。5. CG30Thiem等（1989b）发现，在AcNPV主要衣壳蛋白基因VP39的下游有一CG30基因，相当于OpNPV的OP基因，它们编码的蛋白具有转录调节蛋白的特点，有2个结合核酸的结构域：一为“锌指”（Zinc finger）结构域，CX2CX11CX2C；另一为“Leu拉链”（Leu zipper）结构，（Leu-X7）7。（五）基因重组根据酶切分析，在AcNPV中存在大量的基因型突变株，包括DNA缺失、插入，以及含有宿主细胞DNA插入的突变株。一种常见的现象是，在关系密切的杆状病毒间发生重组，如AcMNPV与RoMNPV之间，以及AcMNPV与GmMNPV之间。前者在草地夜蛾细胞培养中的重组率为7%。高浓度病毒的连续传代也可获得突变体，且常有额外的DNA插入，大小在1.5kb和18kb之间。另外，还有一种FP（Few polyhedra）突变株，这类突变株常是在病毒基因组的特定区域内（Hind I）插入了一段宿主细胞的DNA。三、杆状病毒感染的分子机理在16世纪时，昆虫杆状病毒感染称之为黄疸。幼虫感染后有典型的症状，感染后24小时内停食，不辨方向，行动缓慢，继而外皮发生颜色改变，常变得有光泽，脆性增加，体液可从破裂处溢出，内容主要是病毒的多角体蛋白，常呈白色。病程约5天。病毒可以侵犯脂肪体、皮下组织、气管基质、肌肉、神经纤维、神经节和心包细胞等。幼虫常因食用带有NPV和GV的多角体而感染。幼虫的肠液呈碱性，在此条件下，多角体蛋白被降解，释放的病毒颗粒为PDV。随后PDV出现在中肠的柱状细胞微绒毛处，病毒以其外膜与微绒毛融合而进入细胞，并在核内繁殖。此时，虽然有多角体蛋白合成，但不形成实体。已带有包膜的病毒在基底膜积累，进入血淋巴，从而感染血细胞，病毒可从血细胞芽生。芽生的CRV在pH中性条件下即可感染其它细胞。CRV主要是在机体内细胞与细胞之间传播与感染，而PDV主要是在昆虫与昆虫之间传播与感染。但是，CRV经口也有感染性。CRV对草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）或粉纹夜蛾（Tricho-lusiani）细胞有很高的感染性，病毒经过细胞融合可进入胞内，然后很快就脱衣壳，其病毒基因组进入核内。病毒在细胞核内繁殖。有一种64kDa的糖蛋白，对CRV在组织培养中与细胞相互作用是很重要的。在PDV中未发现这类蛋白。NPV的DNA是具有感染性的，病毒DNA须成环状才有感染性，DNA结合蛋白可以增强其感染性。病毒DNA感染宿主范围与活病毒是相同的。AcMNPV的研究表明，在感染后6小时病毒DNA即开始复制，CRV在感染后10小时产生，12小时后可以发生多角体蛋白，但是，病毒包涵体要到感染后1824小时才能发现。在病毒感染后3648小时细胞外病毒量最高，但多角体蛋白却在45天内继续增加，直至细胞溶解。病毒的繁殖周期见图10-12。 图10-12 杆状病毒繁殖周期（引自Luchow et al.,.,1988）近年来在基因工程的实验中，以杆状病毒为载体，高效表达外源基因，日益受到人们的重视，原因是： （1）杆状病毒对人畜是安全的，构建重组杆状病毒也不需要经过任何具有致癌潜力的转化细胞系； （2）杆状病毒有庞大的基因组，外源基因的插入容量较大，重组病毒仍能在昆虫的幼虫或细胞培养上正常繁殖； （3）多角体基因的启动子效率甚高，本身的表达水平高达1mg/ml/11062mega细胞，达整个细胞蛋白的50%左右，外源基因的表达水平可高达500g/ml； （4）多角体基因编码区为非必需区，并不影响细胞外病毒的复制，外源基因插入灭活后形成非包含体的病毒Occ-，后者形成的空斑明显不同于Occ+病毒形成的空斑，依此标志极易选出重组病毒； （5）目前凡由杆状病毒载体表达的外源蛋白，在抗原性、免疫原性和功能上均与天然的相似。 目前，许多外源基因，包括细菌、病毒、植物和动物的基因，用杆状病毒载体均获得高水平的表达（表10-3）。重组病毒构建的基本原理与痘苗病毒载体相类似（见图10-13）。表103 外源基因在重组昆虫病毒中的表达基 因 来 源 大小(bp) 蛋白质(kDa) 生物学活性 文 献 AcMNPV多角体蛋白 基因组 1 050 29 磷酸化，核内 Hooft et al., 1983蓝舌病毒，VP2 cDNA 2 800 93 免疫原性（VP2） Inumaru et al., 1987蓝舌病毒，VP3 cDNA 2 800 92.5 中和活性（VP3） Inumaru et al., 1987果蝇KDArueppel cDNA 72 结合ssDNA和dsDNA抗原 基因产物 性磷酸化，核内 Ollo et al., 1987CAT 基因组 785 27 CAT活性，抗原性 Luchow et al., 1988CAT 基因组 27 CAT活性 Carbonell et al., 1985半乳糖苷酶融合蛋白 基因组 9 200 120 gal活性 PennocKDA et al., 1984半乳糖苷酶 基因组 3 000 110 gal活性抗原性 Summers et al., 1987 cDNA 572 25/22 抗原性 Lanford et al., 1987HBcAg cDNA 1 236 29/25 抗原性，糖基化， Lanford et al., 1987 形成脂蛋白颗粒人cmyc原癌基因 cDNA 64/61 抗原性，磷酸化核内 Miyamoto et al., 1987人CSF-1 cDNA 34 CSF1活性，抗原性， Inlow et al., 1987 糖基化，分泌二聚体HuIFN 19.5 IFN活性，抗原性，信 Maeda et al., 1987 号肽被切割，分泌HuIFN 基因组 780 17/20.5 IFN活性，抗原性，糖 Smith et al., 1983 基化,切割信号肽,分泌HIVenv cDNA 2 700 150/120 抗原性，糖基化蛋白酶 Hu et al., 1987 130/41 加工HIVenv cDNA 160/120 抗原性，免疫原性，糖 Cochran et al., 1987 基化HIVgag cDNA 1 818 55/40 抗原性，蛋白酶加工 Madisen et al., 1987HIVgag-pol cDNA 3 114 24/55/40 抗原性，蛋白酶加工 Madisen et al., 1987HTLV-1p40 cDNA 1 750 40 HTLV1LTR启动子 Jeang et al., 1987 的反式激活，抗原性， 磷酸化，核内人IL2 cDNA 1 000 16/15.5 IL2活性，抗原性， Smith et al., 1985 信号肽被切割，分泌人副流感病毒 cDNA 1 716 70 HA，HAd活性，HA Coelingh et al., 1987 抑制活性，抗原性， 免疫原性，中和活性， 保护性，糖基化，细 胞表面流感病毒多聚酶PA cDNA 2 200 87 抗原性 St Angelo et al., 1987流感病毒多聚酶PB1 cDNA 2 300 93 抗原性，形成PB1 St Angelo et al., 1987 PB2复合物流感病毒多聚酶PB2 cDNA 2 300 85 抗原性，形成PB1 St Angelo et al., 1987 PB2复合物流感病毒（鸡瘟）HA cDNA 1 750 HA, HAd活性 KDAuroda et al., 1986 溶血活性 抗原性 免疫原性 中和活性 保护性 糖基化，蛋白酶切 割细胞表面流感病毒（A/PR8/ cDNA 65 HA，HAd活性， Possee et al., 1986 34）HA 糖基化，蛋白酶 切割，细胞表面 Matsuura et al., 1987ICMV糖蛋白前体 cDNA 3 300 72 抗原性，糖基化 Matsuura et al., 1986 GPC 细胞表面LCMVN cDNA 3 300 62 抗原性N.crassa激活蛋白 基因组 2 900 100 位点特异性结合 Baum et al., 1987 DNA菜豆phaesseolin cDNA 1 400 51/45 抗原性，糖基化分泌 Bustos et al., 1987多瘤病毒T抗原 cDNA 100 起点特异性结合 Rice et al., 1987 DNA，抗原性伪狂犬病 46 抗原性，免疫原性 Thomsen et al., 1987 gp50 保护性，糖 基化（O-连 接）Punta Toro白蛉 cDNA 1 900 27 抗原性，免疫原性 Overton et al., 1987 病毒N蛋白 中和活性Punta Toro白蛉 cDNA 1 900 26 抗原性，免疫原性 Overton et al., 1987猴轮状病毒SA11 cDNA 1 397 41 抗原性，免疫原性 Estes et al., 1987 核壳蛋白VP6 寡聚SV40T，t抗原 基因组 2 702 19 抗原性，正确的t Jeang et al., 1987 拼接马铃薯主要块 cDNA 1 400 40 类脂酰基水解酶活 Andrews et al., 1988 茎蛋白 性，酰基转移酶活 性，抗原性图10-13. 构建重组杆状病毒示意图（引自Luchow et al., 1988）利用重组杆状病毒高效表达外源基因的理论基础是杆状病毒基因组的结构与调控原理，特别是多角体和其它晚期基因表达的调控原理。但是，迄今这方面在分子水平上了解得很不充分。除基因调控之外，重组病毒繁殖的外环境也很重要，例如AcNPV多角体蛋白的表达水平常受被感染组织或细胞种类的影响，也受细胞的生理状况，乃至细胞培养基质量的影响。一个外源基因在重组杆状病毒中能否高效表达，因素也十分复杂，差异程度可以相差500倍。一般来说有三方面的因素：1重组病毒繁殖的细胞条件，其中细胞的种类和生理状态最为重要；2外源基因本身的因素。已在重组杆状病毒中有效表达的外源基因5-端和3-端非编码序列的长度为3400个核苷酸。影响表达水平的其它因素，包括密码子的使用情况，是否为昆虫细胞所常用，RNA的稳定性，蛋白加工，搬运蛋白稳定性，等等。外源基因ATG附近序列十分重要。Kozak(1983)分析了数百个真核mRNA序列，得出两点结论：首先是启动子下游第一个ATG常作为起始密码子，其次是在ATG附近序列并不是随机的。有95%的发表的真核基因在ATG前-3位是嘌呤，而且常是A，+4是G（Kozak 1981,1984）。如果-3位的A或+4位的G被嘧啶所代替，翻译水平下降20倍（Kozak 1986）。据此，Kozak指出，（GCC）GCCA/GCC AUG G是高等真核基因起始密码附近的保守序列（Kozak 1987）。LutcKDAe等（1987）对此作了修改，以适用于植物的ATG附近保守序列：AACAAUGGC。关于杆状病毒在（四）节中已讲到，-3处A最为保守。3. 重组病毒基因表达的调节，这是最重要的。1983年Smith等首先使用AcNPV表达人干扰素时，构建了4种表达载体，将外源基因分别插入原多角体基因的+175位、+35位、+34位和-59位。结果，在-59位插入人干扰素基因，表达量最高可达5.17mIU/ml。这似乎说明，多角体ATG上游至59位这段序列对下游基因的表达不起作用。但是Matsuura等（1987）用LCMV的N蛋白、糖蛋白前体（GPC）以及流感病毒HA基因进行的研究表明，表达水平的高低与多角体蛋白5-上游序列的完整性有关。5-端上游区至少要保留到-16（表104），否则表达量明显降低。他构建了一个保留全部5-端序列、缺失全部多角体的结构基因的表达载体，表达LCMV的N蛋白，其表达量达全部细胞蛋白的50%。表达LCMV的GPC蛋白，表达量达全部细胞蛋白的20%。然而Luckow等（1988）构建了一系列的载体（图10-14），用三种外源基因：高表达的gal中表达的CAT，低表达的tPA（Tissue plasminogen activator）进行的研究又表明，保留一部分多角体的5-端序列与外源基因以相同的框架相融合，如此表达的融合蛋白，其表达量最高。如果融合时，框架不相同，那么离多角体的ATG下游不远的ATG可以重新起始翻译，这时非融合蛋白的表达量较低，但融合的mRNA水平与框架相同融合时产生的mRNA相当。并认为多角体紧靠ATG上游的序列对基因的转录调节是重要的。表10-4. 多角体基因5-端上游区在重组AcNPV中对流感病毒血凝素基因（HA）表达的影响 5-端缺失程度 HA活性载 体 （以ATG为起点计算） （滴度/106细胞）pAcRP18 0 160pAcRP6 7 160pAcRP22 11 120pAcRP20 14 160pAcRP21 16 120pAcRP3 27 40pAcRP5 31 40pAcRP7 46 10pAcRP1 51 0pAcRP8 58 0图10-14. 用于表达非融合蛋白的杆状病毒载体的部分序列（引自Luckow et al., 1988）目前，世界上常用的插入载体，大多来自美国Texas A.M大学昆虫系，用于表达融合蛋白的有pAc401、pVL101、pAc436、pVL106、pAc409 、pAc311、pAc360、pAc101、pAc700、pAc701、pAc702，上述载体在外源蛋白的N端加有158个多角体蛋白的氨基酸序列；用于表达的非融合蛋白的有pAc373、pAc461、pAc610、pAc611，其中效果最为理想的是pAc373（图1014，1015，1016）。用pAc373为载体表达非融合蛋白，外源基因的前导序列要短。因为多角体的前导序列AT十分丰富，所以外源基因的5-前导太长或CG丰富的话，应在插入载体前就尽可能地切除其多余的序列。除多角体的聚（A）位点外，最好使用其外源基因本身的聚（A）位点。鉴于AcNPV基因组没有内含子，无拼接功能，迄今高水平表达的外源基因均用cDNA或无内含子的基因组。但是Jeang等（1987）报道，加用SV40t抗原的拼接信号可以表达有内含子的外源基因。表10-15. 杆状病毒表达载体的部分序列（引自Luckow et al.,1988）小字字母为人工接头。图10-16. pAc373物理图（引自Luckow et al., 1988）五、杆状病毒作为杀虫剂的应用