细菌的生理生化反应实验.doc

细菌的生理生化反应实验一目的与意义一般来说，对一株从自然界或其他样品中分离纯化的未知菌种的鉴定要做以下几个方面工作。个体形态观察，进行革兰氏染色，分辨是G（+）菌还是G（-）菌。并观察其形状、大小、有无芽孢及其位置等；菌种形态观察，主要观察其形态、大小、边缘情况、隆起度、透明度、色泽、气味等特征；做动力试验，看他能否运动及其鞭毛着生类型（端生、周生）；做生理生化反应及做血清学反应实验。最后根据以上实验项目的结果，通过查阅微生物分类检索表，给未知菌进行命名。此实验为生理生化反应实验，就是使不同种类的细菌在对营养物质的利用、代谢产物的种类、代谢类型等方面表现出差异，故利用这些差异作为细菌分类作为细菌分类鉴定的重要依据。要求在此实验中了解细菌在不同底物环境中各种代谢途径和产物，加深理解细菌生化反应原理；根据细菌在培养基中生理生化特点，学会鉴定细菌。生理生化反应的项目很多。本实验结合肠道杆菌科的分类鉴定，选作其中重要的几项实验。二材料与用具1.菌种：大肠杆菌、沙门氏菌。2.培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖）糖发酵半固体培养基（添加溴甲酚紫试剂）、葡萄糖蛋白胨水培养基、童汉氏蛋白胨水培养基、柠檬酸盐斜面培养基（添加溴麝香草酚蓝变色范围pH6.8 绿pH7.6 蓝）、三糖铁琼脂培养基。3.试剂：甲基红指示剂、40%NaOH、吲哚检验试剂（对二甲基氨基苯甲醛）、双氧水等。4.用具。酒精灯、接种环、接种针、试管等。三实验内容与方法1.糖（醇）类发酵实验多数细菌都能利用糖类作为碳源及能源，但各种菌因含有不同发酵糖（醇）类的酶，故表现出有的能分解或不分解某些糖类，有的分解糖产酸，并产气，或只产酸不产气，可根据这些特点鉴别细菌（培养基中指示剂溴甲酚紫pH6.8以上呈紫色，pH5.2以下呈黄色）。大肠杆菌与沙门氏菌的生理生化鉴定区别操作：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖）糖发酵半固体培养基（添加溴甲酚紫试剂）中，无菌操作，穿刺接种，37培养1天。记录：阴性不产酸（紫色）；阳性产酸（黄色）。2.甲基红（MR）实验某些菌在糖代谢过程中，分解糖类，产生丙酮酸，继而再分解为各种酸，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为阳性反应；若分解糖产酸少，或所产生的酸转换为其他物质，则培养基pH在4.5以上，加入指示剂呈黄色，为阴性。操作：葡萄糖蛋白胨水培养基中，无菌操作，斜面取菌接种，37培养2天。观察时加入甲基橙试剂。3.维培（VP）二氏实验某些菌能从葡萄糖丙酮酸缩合、脱羧为乙酰甲基甲醇，继而再有些碱存在时氧化成双乙酰，双乙酰与培养基中蛋白胨中的精氨酸胍基起作用，产生粉红色化合物（加入肌酸或肌酐等胍基化合物可加速此反应）。操作：葡萄糖蛋白胨水培养基中，无菌操作，斜面取菌接种，37培养2天。观察时加入与培养基等量的40%KOH溶液。记录：粉红色阳性；无反应阴性。4.吲哚（靛基质）产生实验某些细菌具有色氨酸水解酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，后者与对二甲基氨基苯甲醛结合，生成红色的玫瑰吲哚化合物。操作：童汉氏蛋白胨水培养基中，无菌操作，斜面取菌接种，37培养2天。观察时加入吲哚试剂，摇匀。记录：有玫瑰环阳性；无反应阴性。5.柠檬酸盐利用实验某些菌利用柠檬酸盐为碳源，在有水存在的情况下，将柠檬酸盐水解为柠檬酸和强碱。由于细菌不断利用柠檬酸生成CO2，使培养基中柠檬酸浓度下降，强碱化合物浓度上升，导致pH值由中性变为碱性，使培养基中指示剂发生绿转蓝的变化。操作：柠檬酸盐斜面培养基（添加溴麝香草酚蓝变色范围pH6.8 绿pH7.6 蓝）中，无菌操作，划线接种，37培养2天。记录：蓝阳性；绿阴性。6.三糖铁实验有些菌分解糖产生H2S，H2S与Fe3+反应生成FeS黑色沉淀。且糖被分解产酸使培养基呈黄色，表面进一步氧化呈红色。操作：三糖铁培养基中，无菌操作，先进行穿刺接菌，再进行划斜面接菌，37培养2天。记录：产生黑色物质阳性；无反应阴性。四现象总结：（1）糖发酵试验 大肠杆菌能利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇； 沙门氏菌能利用葡萄糖和甘露醇，不能利用蔗糖和乳糖。（2）甲基红试验 大肠杆菌与沙门氏菌均为阳性反应。（3）维培二氏试验 大肠杆菌与沙门氏菌均为阴性反应。（4）吲哚试验 大肠杆菌具有色氨酸水解酶，可生成红色的玫瑰吲哚化合物； 沙门氏菌为阴性。（5）柠檬酸盐利用试验 大肠杆菌为阴性； 沙门氏菌为阳性。（6）三塘铁试验： 大肠杆菌不利用含硫氨基酸，不产生H2S，也即没有黑色沉淀，且斜面为红色，底部呈黄色； 沙门氏菌可利用含硫氨基酸，产生H2S，生成FeS黑色沉淀，且斜面为红色，底部呈黄色。菌种糖发酵试验甲基红试验V.P吲哚试验柠檬酸盐利用三糖铁试验葡萄糖乳糖