营养缺陷型菌株的筛选.doc

营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为-）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。完全培养基(CM，符号为+)是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。补充培养基（SM，符号为A或B等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。 营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。抗生素法 有青霉素法和制霉菌素法等数种。青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。菌丝过滤法 适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。第三步，检出缺陷型：具体方法很多。用一个培养皿即可检出的，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的，有逐个检出法和影印接种法。可根据实验要求和实验室具体条件加以选用。现分别介绍如下：夹层培养法 先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基，待凝，添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基，经培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。然后再加一层完全培养基，培养后新出现的小菌落多数都是营养缺陷型突变株。限量补充培养法 把诱变处理后的细胞接种在含有微量（0.01%）蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞就迅速长成较大的菌落，而营养缺陷型则缓慢生长成小菌落。若需获得某一特定营养缺陷型，可再在基本培养基中加入微量的相应物质。逐个检出法 把经诱变处理的细胞群涂布在完全培养基的琼脂平板上，待长成单个菌落后，用接种针或灭过菌的牙签把这些单个菌落逐个整齐地分别接种到基本培养基平板和另一完全培养基平板上，使两个平板上的菌落位置严格对应。经培养后，如果在完全培养基平板的某一部位上长出菌落，而在基本培养基的相应位置上却不长，说明此乃营养缺陷型。影印平板法 将诱变剂处理后的细胞群涂布在一完全培养基平板上，经培养长出许多菌落。用特殊工具“印章”把此平板上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培养后，比较前后两个平板上长出的菌落。如果发现在前一培养基平板上的某一部位长有菌落，而在后一平板上的相应部位却呈空白，说明这就是一个营养缺陷型突变株。第四步，鉴定缺陷型：可借生长谱法进行。生长谱法是指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，视某营养物的周围有否长菌来确定该供试菌的营养要求的一种快速、直观的方法。用此法鉴定营养缺陷型的操作是：把生长在完全培养液里的营养缺陷型细胞经离心和无菌水清洗后，配成适当浓度的悬液（如107108个ml），取0.1ml与基本培养基均匀混合后，倾注在培养皿内，待凝固、表面干燥后，在皿背划几个区，然后在平板上按区加上微量待鉴定缺陷型所需的营养物粉末（用滤纸片法也可），例如氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶碱基等。经培养后，如发现某一营养物的周围有生长圈，就说明此菌就是该营养物的缺陷型突变株。用类似方法还可测定双重或多重营养缺陷型。 工业微生物菌种的选育营养缺陷型菌株的筛选来源：青岛海博 关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同 关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用来表示。完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。用来表示。补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。 （一）、营养缺陷型菌株的分离和筛选一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。1、营养缺陷型的诱发 营养缺陷型的诱变方法和诱变因子与普通诱变育种基本相同。2、淘汰野生型 在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少，一般仅占存活菌体的百分之几或千分之几，而野生型细胞却大量存在，因而要采取一些措施，尽量淘汰野生型细胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于检出。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。（1）抗生素法：细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。（2）菌丝过滤法 真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔34h过滤一次，重复34次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀释、涂皿分离。（3）高温杀菌法 利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓缩作用。3、营养缺陷型的检出 营养缺陷型菌株的检出方法有：点植对照法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。（1）点植对照法诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证。该法可靠性强，但工作量大。（2）影印法经富集后的孢子或菌体分离在完全培养基培养至菌落成熟（母皿），用灭菌后的特制“丝绒印模”在母皿平板菌落上轻轻一印，再转印到方位相同的另一基本培养基和完全培养基的平板上。培养后观察比较菌落生长情况，凡是在基本培养基上不生长，而在完全培养基上生长的菌落，分别移接到以上两种培养基斜面上进一步复证。另外还可采用更简便的方法，以上印模从母皿中沾上菌体细胞后，仅影印在基本培养基平板上，培养后，生长的菌落情况与存放于冰箱的母皿菌落比较即可检出营养缺陷型。本法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌落的放线菌和霉菌也适用。（3）限量补充培养法如果试验的目的仅是检出营养缺陷型菌株，则其该法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01%蛋白胨的基本培养基上，培养后，野生型细胞迅速地长成大菌落，在平皿底部作好颜色标记，而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型，此称限量培养。如果试验的目的是要定向筛选某种特定的缺陷型，则可在基本培养基中加入某种单一的氨基酸、维生素或碱基等物质，称为补充培养。（4）夹层培养法先在培养皿上倒一薄层基本培养基，凝固后再倒一层经过诱变处理的菌液，其上再浇一层基本培养基；经培养后，对首次出现的菌落用记号笔在皿底标记，然后再倒一层完全培养基，再培养，出现的形态较小的新菌落，多为缺陷型。4、营养缺陷型的鉴定 （1）营养缺陷型鉴定步骤A、缺陷型类别的测定通常分别用以下物质来代表氨基酸、维生素、核酸碱基：氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸类酵母浸出液，基中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均有维生素混合物，代表维生素类核酸碱基混合液，代表嘌呤、嘧啶类。 将待测微生物从斜面上用生理盐水或缓冲液乔洗下来，离心洗涤，制成浓度为106108ml-1菌悬液，取0.1ml加入到基本培养基中，混匀倒入平皿，制成平板。凝固后，用加圆滤纸分别浸湿沾取以上四类代表物质，覆于平板标定的位置上。培养后，观察圆滤纸片周围菌株生长情况，如出现混浊的生长圈，就可初步确定缺陷型所需的生长因子属于哪一类别，进一步复证。B、缺陷型所需生长因子的测定在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况，称为生长谱法。单一生长因子：鉴定氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方法是分组测定法。将21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨基酸归为一组。如果以15种维生素进行测定，则把5种维生素归为一组，共5个组合。组别 氨基酸组合组 1 赖氨酸 精氨酸 蛋氨酸 胱氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 2 缬氨酸 精氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 组氨酸 3 苏氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 谷氨酸 脯氨酸 天冬氨酸 4 丙氨酸 胱氨酸 酪氨酸 谷氨酸 甘氨酸 丝氨酸 5 鸟氨酸 亮氨酸 色氨酸 脯氨酸 甘氨酸 谷氨酰胺 6 胍氨酸 异亮氨酸 组氨酸 天冬氨酸 丝氨酸 谷氨酰胺 组别 维生素组合组 1 维生素A 维生素B1 维生素B2 维生素B6 维生素B12 2 维生素C 维生素B1 维生素D2 维生素E 烟酰胺 3 叶酸 维生素B2 维生素D2 胆碱 泛酸钙 4 对氨基苯甲酸 维生素B6 维生素E 胆碱 肌醇 5 生物素 维生素B12 烟酰胺 泛酸钙 肌醇 测定方法：缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板，把5组或6组生长因子直接加于同一琼脂平板上，或用滤纸片沾取后覆于琼脂平板上，培养后，观察哪一组或哪两组区产生混浊生长圈，即可确定该菌株缺陷的生长因子。 如果要测定数十或上百个缺陷型菌株时，则可改成一个平皿中加入一种生长因子，制成平板，在翻转平皿底部，几十个方格子