胡萝卜组织培养.doc

. 研究背景1.1 胡萝卜胡萝卜(Daucus carota L)为伞形科植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一，占蔬菜生产总量的3，达135百万吨(Hole，1996)。胡萝卜块根营养丰富，约含有88的水、68糖、12植物纤维，0712蛋白质、1灰份及03脂肪1 。由于其富含维生素A前体类胡萝b素和植物纤维，因而是一种重要的营养保健品。其适于生食、加工、烹调等多种用途。中国是农业大国，胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此继续深入研究胡萝卜细胞培养还是很有必要的。 1.2 组织培养 植物组织培养是在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术2。其理论基础是植物细胞具有全能性，即一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，具有发育成完整植株的潜能，在适宜的条件下能够发育成一个完整的植株。进行离体培养时，植物的组织或器官通过脱分化形成愈伤组织。胡萝卜价格比较便宜，材料易得，而且在组织培养方面容易诱导发生，我们可以通过这个实验熟悉植物组培。2. 材料与方法2.1 材料培养皿、锥形瓶、无菌纸、镊子、解剖刀、烧杯、量筒、玻璃棒、酒精灯、无菌操作台、高压灭菌锅、微波炉、PH试纸。MS培养基、2,4-D、6-BA、活性炭、无菌水、蔗糖、琼脂粉、75%酒精、1% (体积比)浓度的次氯酸钙溶液、胡萝卜块根（2012-2-21-怡购，2012-2-24-水果摊，2012-3-13-水果摊，2012-3-21-珠影，2012-3-29-荣一）2.2 方法2.2.1 MS培养基的配制200mlu 用大烧杯取无菌水100-120mlu 依次用移液管量取加入母液：20ml大量（10x）、2ml微量（100x）、2ml铁盐（100x）、4ml有机（50x）、2mg/L2,4-D。 u 称取6g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解。u 用量筒定容至20ml。u 用pH试纸调pH至6.0-6.2u 称取1.6g琼脂加入，搅拌。u 放入微波炉内加热直至清澈无沉淀。u 分装后高压灭菌3h。探究实验1激素为1.0mg/L2,4-D，1.0mg/L6-BA3探究实验2激素为2.2mg/L2,4-D3 42.2.2 培养条件u 接种环境1先用75%酒精擦拭无菌操作台的内部6个面。2将现配的75%的酒精、1%次氯酸钠、刀、镊子、无菌纸、无菌水、小烧杯、培养皿、废液缸、试管架、打火机等操作用的工具放置到相应位置。3将酒精灯添加适当的酒精（不超过容积的2/3），并检查是否可以点燃。4先开紫外灯40min，后再通风20min。5进入操作台的物品都要经酒精消毒。u 操作过程及有关条件1在无菌操作台上操作。2点燃酒精灯，倒平板。3消毒外植体。把清洗好的胡萝卜块根放入无菌操作台，消毒先用75%酒精对胡萝卜直根消毒10s 再用1%的次氯酸钙溶液消毒78min，用无菌水冲洗3次，放入成有无菌水的烧杯中待用。4拆刀镊，并消毒。5切外植体。用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度35mm左右的小圆片，然后如图所示切，将韧皮部和木质部切去，留下形成层。6 接种外植体，45个/培养皿。7 封口。u 培养环境25暗处理3结果与分析3.1 实验数据统计实验周期：实验 当日 第一次观察时间 6天后 结果统计 1214天后表1 五次实验记录统计表 日期 激素类型及浓度(mg/L) 培养盘数 正常盘数A 2-21 2,4-D 2.0 3 0B 2-24 2,4-D 2.0 8 2C 3-13 2,4-D 2.0 4 2D 3-21 2,4-D 1.0，6-BA 1.0 4 2 2,4-D 2.0 4 1E 3-29 2,4-D 2.2 13 63.2 实验结果说明及表格l A中3盘 2盘染菌 1盘干枯l B中8盘 1盘染菌 5盘玻璃化2盘正常40%愈伤l C中4盘 2盘染菌 2盘褐化-移盘后 1盘染菌 1盘60%遇上l D中4盘 2盘褐化 2盘愈伤70% 4盘 1盘染菌 1盘玻璃化 1盘培养皿损坏 1盘愈伤50%l E中13盘2盘染菌2盘褐化 3盘玻璃化 6盘愈伤70%表2 五次实验结果统计表 激素及浓度(mg/L) 异常盘数 异常原因 正常盘数 诱导率A 2,4-D 2.0 3 染菌干枯B 2,4-D 2.0 6 染菌玻璃化 2 40%C 2,4-D 2.0 2 染菌褐化 2 60%D 2,4-D 1.0，6-BA 1.0 2 褐化 2 65% 2,4-D 2.0 3 染菌玻璃化 1 60%E 2,4-D 2.2 7 染菌褐化玻璃化 6 70%3.3 不同激素对胡萝卜愈伤诱导的影响表3 不同激素愈伤组织诱导率激素类型及浓度(mg/L) 诱导质量 诱导率 2,4-D 2.0 + 53.4% 图12,4-D 2.2 + 70% 图22,4-D 1.0，6-BA 1.0 + 65% 图3图1图2图34. 讨论通过组织培养建立植物再生系统时，基本培养基附加激素的种类和浓度、操作手法等因素都会对再生植株的分化率产生很大的影响，从而影响遗传转化的成败。激素的种类和浓度在建立再生系统中起很重要的作用。在实验过程中发现当使用单种激素2,4-D时，浓度增大会更容易诱导愈伤组织。但因实验次数有限，无法多次实验检验实验结果；因设计浓度梯度有限，未能确定最佳浓度配比。2,4-D与其他激素混合使用时，愈伤诱导情况要好于使用单种激素，但诱导率仍不理想。预计生长素与细胞分裂素的配比不同，胡萝卜块根诱导质量也不同，应进一步实验，得出最佳配比度。对于在探究学习阶段的我们，我认为实验操作手法对植物再生系统的建立成功与否也起到很大影响。根据几次实验总结失败原因：u 染菌：零星分布在培养基中-操作问题；沿外植体生-灭菌，工具问题；数天后沿外植体生长-外植体本身问题。u 褐化：切割机械损伤；品种本身；激素母液浓度；温度光照。可添加0.10.5%活性炭。u 玻璃化：激素浓度；琼脂用量；切割机械损伤；温度过低光照时间通风条件。u 无变化：激素种类或浓度配比。u 愈伤组织紧密：细胞分裂素过高，激素浓度不当。试验中应积极尝试，从不足中找到问题，及时思考并改正，这样才能取得进步。5. 主要参考文献： 1颜昌敬著植物组织培养手册M上海：上海科学技术出版社，19894514532安利国主编. 细胞工程M. 科学出版社，2011,73郑回勇，