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北京家禽育种有限公司保健中心作业指导书 受控 文件编号:BPBC-QD-HC04 第 38 页 共 37 页 保健中心检验程序血清学一血清平板凝集试验细菌等颗粒性抗原的悬液与相应的抗体结合后,在电解质的参与下，抗原颗粒相互凝集形成团块,这种现象叫做凝集反应。操作程序：在洁净的白瓷反应板(或玻璃板)上，滴加待检血清一滴(约30ul)，然后加一滴(约30ul)抗原于血清中，使其充分混合，轻轻摇动平板2分钟，判定结果。如在2分钟内出现明显的凝集块，背景清亮即可判为阳性；介于二者之间判为可疑。同时，阴阳性对照应分别呈阴阳性结果。本试验应在22以上的环境中进行，每次进行反应时应有阳性血清和抗原对照。使用前将抗原和血清从冰箱取出，待其温度接近室温时再做试验。使用前将抗原充分摇匀，每次检测时作阳性、阴性血清及盐水对照。并检测一下抗原是否有自凝现象，如抗原污染细菌或霉菌，出现自凝颗粒或霉团时应废弃。如抗原一次使用不完，剩余部分应放回冰箱保存。附：全血平板凝集反应操作方法：在洁净的白瓷板或玻璃板上，滴上鸡白痢-鸡伤寒抗原一滴(约0.05毫升），立即用针头刺破鸡肱静脉，用取血环(内径7.5-8.0毫米金属丝环)取2满环血(约0.05毫升)加入抗原中，充分混匀，轻轻摇动。一般在20秒钟内出现反应，2分钟判定结果。二免疫扩散试验免疫扩散试验又称琼脂凝胶扩散试验(AGP)。其原理是抗原抗体在含有电解质的琼脂凝胶中可以向四周自由扩散，当抗原、抗体扩散至适当部位相遇时，则出现肉眼可见的沉淀线，这是抗原抗体的特异性结合物，可以用此试验测定未知的抗体或抗原。免疫扩散试验可诊：鸡传染性法氏囊病，鸡传染性支气管炎，鸡马立克氏病，禽脑脊髓炎，鸡病毒性关节炎，禽流感，鸡痘，禽霍乱，鸡传染性鼻炎，禽白血病，鸡传染性喉气管炎。在免疫扩散试验中，虽然琼脂平板的制备随诊断的疾病而异,但其操作方法基本相同。大体有三种，即：PBS，0.8%PBS，BBS。琼脂平板由供应室制备。在试验前，将抗原及阳性血清按稀释的要求配制。从冰箱取出备用的琼脂板，用外径为4毫米的打孔器按六角形图案打孔，中心孔与周围孔的孔距为3毫米。将孔中的琼脂用6-8号针头轻轻向上挑出即可。在酒精灯上稍加热，蒸发其表面水分，即封底，目的是防止琼脂与平皿底脱离。然后作好标记，准备加样品。中心孔滴加抗原，1、4孔加入阳性血清。2、3、5、6孔各加入待检血清（抗原和待检血清各孔加约30微升，每加一份血清更换一个滴头。）加至孔满为止，但不要溢出。待孔中液体吸干后，将平皿倒置，放入37温箱中，保持一定的湿度，经 24-48小时后，在8瓦日光灯下观察结果。判定：1阳性：标准阳性血清与抗原之间有明显致密的沉淀线时，受检血清与抗原之间也形成沉淀线或者阳性血清的沉淀线末端向毗邻的受检血清孔内侧偏弯者，此受检血清判为阳性。2阴性：受检血清与抗原之间不形成沉淀线或者阳性血清的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或其向外侧偏弯者，此受检血清判为阴性。三红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）的操作程序（一） 鸡新城疫（ND）的HA 和HI试验1试验准备1-1抗原：从中监所或哈兽研买的已知抗原。1-21%红细胞悬液的配制由鸡翅静脉或心脏采血，放入红细胞保存液内（保存液2份，血液1份），混匀。将此血液注入离心管中，经2000转/分钟，离心5分钟，用吸管吸去上清夜和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加0.9% 生理盐水洗涤；再经2000转/分钟，离心5分钟，弃去上清夜，加0.9% 生理盐水洗涤。如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按1% 的稀释度加入生理盐水（1毫升红细胞泥加99毫升0.9% 的生理盐水）。1-3 被检血清：由鸡场送来的装有全血的采血管，经10000转/分钟，离心5分钟，待血清析出后使用。1-40.9%生理盐水：由供应室提供。1-5红细胞保存液：由供应室提供。2红细胞凝集试验（HA）HA试验主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用的病毒稀释倍数（抗原单位）。本试验采用96孔V型微孔塑料板，可同时测8个样品。2-1 用12头移液器向每个孔中加入0.9%生理盐水0.05毫升。 2-1用单头移液器吸取0.05毫升待测病毒抗原液加入第一孔中，进行反复稀释（此时应注意不要产生气泡），一般挤压5次即可，使病毒液与生理盐水充分混匀，再吸出0.05毫升加入第二孔中，如此连续稀释至第11孔，病毒稀释倍数依次为1:2-1:2048，最后从第11孔中取出0.05毫升弃去。第12孔做红细胞对照孔。每次至少重复测4排病毒液，以消除偶然误差。2-2 用12头移液器每孔各加入1%红细胞悬液0.05毫升。2-3在微型震荡器上震荡，混匀约1-2分钟，再静置。在18-22室温下作用40分钟后观察结果。如下图：孔号123456789101112病毒稀释倍数1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048红细胞对照孔稀释液（m）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05病毒液（ml）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05弃去0.05ml1%红细胞（ml）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05判定（例） +-注：+表示完全凝集，+表示不完全凝集，-表示不凝集。3- 每次测定样品都应做红细胞对照。结果观察：将反应板竖立于桌上，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线形流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞已被病毒所凝集。如上例，病毒液HA效价为1:256，在HI试验时，病毒抗原液0.05 ml内须含4个凝集单位，则应将病毒液 作成256/4=64倍的稀释液。4红细胞凝集抑制试验（HI）新城疫病毒凝集红细胞的作用，能被特异性抗体抑制。因此，可用HI试验测定鸡血清中的HI抗体效价（滴度）。本试验同样采用96孔V型塑料板。4-1 用12头移液器向每个孔加入生理盐水0.05毫升。4-2 用单头移液器吸取待检血清 0.05毫升加入第一孔中，反复挤压5次，使稀释液与血清混匀，再吸出0.05毫升加入第二孔中，如此连续稀释至第12孔，最后弃去0.05毫升。4-3 用12头移液器吸取上述HA试验中4单位病毒液，于每孔中各加入0.05毫升。4-4 置于震荡器上混匀1-2分钟，再在18-22室温下静置20分钟。4-5 用12头移液器吸取1%红细胞悬浮液，各孔加入中0.05毫升。4-6 置于震荡器上震荡混匀1-2分钟，在18-22室温下作用40分钟后观察结果。如下图：孔号123456789101112被检血清稀释倍数1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048红细胞对照孔稀释液（ml）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05被检血清（ml）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05弃去0.05ml病毒液(ml)（4单位）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.051%红细胞（ml）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05判定（例）-+注：+表示完全凝集，+表示不完全凝集，-表示不凝集。4-7 结果判定：将反应板竖立于桌上，沉于管底的红细胞沿着斜面向下呈线状流动者，表示血清中含有足量能抑制病毒液凝集红细胞的抗体；若孔底的红细胞呈现边缘不齐的分散状态，表示血清中的抗体量不足以完全抑制病毒凝集红细胞的作用，或者表示血清中无特异性抗体。 能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释度倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用以2为底数的对数（Log2）表示。上表HI效价为8（Log2）。（二） .鸡减蛋综合症（EDS-76）的HA和HI 试验鸡减蛋综合症（EDS-76）的HA和HI 试验的操作步骤同于鸡新城疫的HA和HI 试验，只是鸡减蛋综合症的HI试验中加入1%红细胞悬浮液，震荡混匀后，在18-22下作用30分钟后观察结果。（三） 鸡毒支原体（MG）的HA和HI 试验1红细胞凝集试验（HA）操作步骤同于ND的（HA）试验，用量也相同。2红细胞凝集抑制试验（HI）2-1用移液器向第1孔中加生理盐水0.09ml，第2孔至第12孔每孔加生理盐水0.05ml。2-2用单头移液器吸取待检血清0.01ml加入第1孔中，反复挤压稀释5次，吸出0.05ml加入第2孔中，如此连续稀释至第六孔，血清稀释倍数依次为1:10-1:320，最后从第六孔中吸出0.05ml弃去。2-3 用12头移液器向各孔加HA试验中的4单位病毒液0.05ml。2-4置于震荡器上震荡混匀1-2分钟，在室温18-22静置20分钟。2-5用12头移液器吸取1%红细胞悬浮液0.05ml加入各孔中。2-6置于震荡器上震荡混匀1-2分钟，在室温18-22静置40分钟后观察结果。2-7结果判定：血清HI抗体效价 80的为阳性。（四） 滑液囊支原体（MS）的HA和HI试验 操作步骤及用量和判定结果全同于鸡毒支原体的HA和HI 试验。（五） 传染性支气管炎（IB）的HA和HI 试验操作步骤及用量同于鸡新城疫的HA和HI 试验，只是在试验中所用的红细胞悬液的浓度为0.75%。（六） 检测血清的禽淋巴白血病ELISA实验程序准备：所有试剂在使用之前都应回复到室温。并且应轻旋混匀。 1取出已包被好抗体的酶标板，作好标记，并在FlockCheck 工作表上作好加样记录。2在A1，A2 孔中各加入100ul 阴性对照样品。3在A3，A4 孔中各加入100ul 阳性对照样品。4将每份待检血清样品100ul 加入相应孔中。样品可作适量的重复。5在室温下孵育60分钟。6将所有孔中的液体甩入一个废液回收容器内。7用约300ul 的蒸馏水或去离子水洗涤每孔3-5遍。每次洗涤都应将水甩净。8在每孔中加入100ul兔抗p27-辣根过氧化物酶结合物。9在室温下孵育60分钟。10重复第6，7两步。11在每孔中加入100ul TMB底物溶液。12在室温下孵育显色15分钟。13在每孔中加入100ul终止液终止反应。14用空气将酶联仪调零。15在650nm波长下测量并记录标准对照孔和样品孔的光吸收值。16计算结果。（七） 检测蛋清的禽淋巴白血病ELISA实验程序浓的蛋白样品有时很难靠标准的水洗过程洗净。试剂盒提供了一种20倍浓度的洗液用于蛋白样品的洗涤。浓洗液应在实验前回复到室温，并且应确保混匀了任何未溶解的沉淀。使用时将浓洗液1:20稀释，如：20ml 浓洗液加入380ml水中，可用于一块酶标板的洗涤。另外，所有试剂在使用之前都应回复到室温，并且应轻旋混匀。 1标准样品及待检样品的处理，与前面检测血清的禽淋巴白血病ELISA实验程序的1-5步相同。2在室温下孵育样品60分钟后，将孔中的液体甩入废液回收容器内。3用将近300ul 一倍浓度的洗液洗涤每孔4遍或更多次。或用300ul 一倍浓度的洗液浸泡2分钟，然后将洗液甩掉。4在每孔中加入100ul兔抗p27-辣根过氧化物酶结合物。5在室温下孵育60分钟。6重复第3步。7在每孔中加入100ul TMB底物溶液。8在室温下孵育显色15分钟。9在每孔中加入100ul终止液终止反应。10用空气将酶联仪调零。11在650nm波长下测量并记录标准对照孔和样品孔的光吸收值。12计算结果。解剖和病理一病理剖检程序1. 观察病鸡临床症状。2. 用注射器采病鸡血液（较大鸡：从翅膀静脉采；较小鸡：从心脏采）放在采血管中并编号。3. 处死病鸡。可用断颈法，或者用注射器经枕骨大孔脑内注射福尔马林溶液的方法。一般用后一种方法。对于要取脑组织做病原分离的情况，则只能用前一种方法。4. 检查病、死鸡羽毛、皮肤、眼、鼻、喙等外表组织器官。5. 仰卧鸡只，用手术剪从腹侧正中剖开皮肤，检查皮下组织、肌肉（包括雏鸡的胸腺等）。6. 往两侧拉伸腿部，使髋关节脱臼，从而使鸡尸体仰卧更稳。7. 用解剖刀切开胸肌，检查深层胸肌及注射油苗情况。8. 用解剖剪从龙骨左侧打开胸腹腔，依次检查肝脏、心脏、气囊、脾脏、性腺、肾脏、胃肠道及其内容物、法氏囊和胸腹腔璧等。9. 检查上消化道（口腔、食道和嗉囊）和呼吸系统（鼻腔、鼻窦、喉头、气管、支气管和肺）。10. 检查全身骨、关节。11. 检查脑、神经。12. 在北京家禽育种有限公司保健中心鸡只尸体剖检记录表中详细记录病理剖检结果。13. 注意事项: 根据具体情况，在剖检过程中要适时选留适宜病料，以备做其他实验室检查用。二病理组织学检验程序1. 采集病变组织及固定: 用刀片将病变组织切成一定大小(一般为11厘米的方块，厚度不超过0.5厘米)的方块，放在10%福尔马林溶液(福尔马林溶液与病变组织的体积比不能低于2:1)中固定24小时以上。对于特殊组织要做特殊的处理。如脑组织，要从脑正中垂直纵切后固定；消化道上皮等不定形的组织，要放在硬纸片上帮助定形后固定。对需要做标记的组织，要放在作上标记的硬纸片上用纱布包裹后固定。2. 切片的制作一般采用石蜡切片的方法。2.1 组织水洗：将固定好的病变组织分成两份，一份放回10%福尔马林溶液中作备份，另一份用纱布包裹后，用流水冲洗5-6小时。2.2 组织脱水：将组织依次放在下列溶液中脱水，脱水时间依组织块大小而定。组织块较大，放置于每种溶液中的时间要长些；反之，则短些。 70%酒精溶液中2-4小时； 80%酒精溶液中2-4小时； 90%酒精溶液中2-4小时； 95%酒精溶液中过夜； 100%酒精溶液中两次，每次1-2小时。2.3 组织透明：用二甲苯透明。透明时间视组织块大小和实际透明情况而定，一般不超过1小时。只要组织块经过肉眼观察已经透明，应马上取出进行下一步。2.4 组织浸蜡：依次置于三种熔点不同的软蜡中各0.5-1小时，最后浸于硬蜡中0.5小时。浸蜡时间视组织块大小可做适当调整。2.5 组织包埋：用不锈钢勺取溶解的硬蜡和组织一起放在事先叠好的长方体形硬纸盒中包埋，待蜡块完全凝固后进行下一步。2.6 组织切片：2.6.1 用切片机将石蜡包埋的组织切成一定厚度的薄片，厚度一般为3-6微米。2.6.2 在38-42的蒸馏水中进行展片，然后将展开的组织薄片附贴在涂有少量甘油蛋白的载玻片上。2.6.3 将切片置于烤箱中烤干(烤片温度一般不超过50，时间约1-3小时)。2.7 石蜡切片的染色： 常用苏木素-伊红染色法。必要时可用其他适宜的染色方法(如PAS-皂黄染色法)。苏木素-伊红染色步骤:2.7.1. 二甲苯脱蜡5分钟；2.7.2.依次置于100%、95%、90%、80%、70%酒精溶液中各放置1分钟；2.7.3苏木素染液染色15分钟;2.7.4.水冲洗30分钟，然后用盐酸酒精分化液作用10-30秒钟；继续流水冲洗10-15分钟；2.7.5伊红染液染色2-5分钟；2.7.6水洗数次；2.7.7依次经70%、80%、90%、95%酒精溶液中脱水各1分钟；然后置于100%酒精溶液中两次，每次2-3分钟；2.7.8.二甲苯透明5-10分钟；2.7.9中性树胶和盖玻片封固；2.7.10.置于37温箱中24-48小时，烘干。3. 切片的观察:借助光学显微镜观察组织切片的病理变化情况，记录观察结果。三鸡病诊断程序1要求送检人员详细填写北京家禽育种有限公司保健中心病例背景登记表，保证填写内容的真实性。2详细检查北京家禽育种有限公司保健中心病例背景登记表中的各项内容，了解有关信息。必要时，需向饲养管理负责人了解其它有关情况，甚至亲自到农场去观察鸡群的情况。3检查病鸡群的血清学检测结果。4检查病死鸡的病理剖检结果。5检查病变组织的病理组织学检查结果。6检查病变组织的病原分离培养及鉴定结果。7检查其他有关化验结果。8综合上述各项检查结果作出诊断并出具报告。四. 抗生素检验程序1. 材料1.1 培养基：同药敏试验检验程序中的培养基。1.2 试验微生物：选择诊断室保存的对待检抗生素(或其同类抗生素)敏感的致病微生物株作为试验微生物。一般选择大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌四种常见致病菌作为试验微生物。在实际检验过程中，应根据抗生素的用途，选择相应病原微生物作为试验微生物。1.3 稀释液：用灭菌蒸馏水。1.4 滤纸片：用打孔器将优质滤纸片制成直径为6毫米的圆形纸片，经121高压蒸汽灭菌，干燥后密闭保存于4-8冰箱中备用。2. 方法：2.1 根据抗菌药物药敏试验判定标准中同类(作用相同或相似)抗生素药敏试验纸片含药剂量，将待检抗生素用灭菌蒸馏水稀释成一定浓度的溶液或混悬液(每5微升液体含有1片药敏纸片中的抗生素量)。2.2 用经无菌蒸馏水浸湿的灭菌棉拭子取新鲜纯培养的试验微生物，均匀涂布于培养基上。2.3 用无菌小镊子取滤纸片平放在培养基表面。2.4 用加样器取5微升混匀的待检抗生素稀释液加到培养基中的滤纸片上，待液体吸入滤纸片和培养基后，将平皿置于37温箱中培养16-18小时。2.5 按照药敏试验检验程序记录结果，并判定试验微生物对受检抗生素的敏感性。3. 结果判定： 根据控制病原微生物的要求，结合上述测试结果，判定受检抗生素是否符合要求。4. 出具抗生素检验报告。药敏试验检验程序1 材料：11 培养基：一般用WHO推荐的MH培养基。对链球菌、嗜血杆菌等细菌加适量（5%）的新鲜绵羊血制成平板。密封于塑料袋中，放4-8的冰箱中保存（不超过7天）备用。12 药敏纸片：根据需要，从有合格证的生物制品制造单位购买。封存于-20冰箱中保存（使用期限以药敏纸片制造单位所附的有效期为准）备用。13 试验菌：新鲜可疑带菌病料，或者经过纯培养的致病菌。2 方法：21 在无菌条件下，取新鲜无污染的可疑含菌临床病料或经过纯培养的致病菌均匀涂抹培养基表面。22 以无菌镊子夹取药敏纸片贴放于培养基表面（每两个药敏纸片之间的及药敏纸片与培养皿边缘之间的最短距离，视药敏纸片所载药物可能产生的抑菌圈大小而定，一般不少于15毫米）。23 将培养皿放置于37的恒温箱中培养18-24小时。24 用直尺测量药敏纸片周围的抑菌圈大小并记录结果。25 如果在记录结果时发现培养皿上没有细菌菌落生长，或者细菌菌落生长不均匀，或者发现所有药敏纸片的周围没有抑菌圈，则必需取经过纯培养的致病菌，重复上述21，22，23，24四个步骤一次。3 结果判定： 根据抗菌药物药敏试验判定标准加以判定。 备注： 有些品种药敏纸片的判定标准资料没有，如阿莫西林、多粘菌素E等参照相关（作用相似）药敏纸片的判定标准。附：抗菌药物药敏试验判定标准抗菌药物代纸片抑菌圈直径(mm)类名号含药量耐药中度敏感敏感别称微克/片（R）（M）（S）氨基庆大霉素 GentamycinGM101213-1415糖甙类新霉素 NeomycinN301213-1617青氨苄青霉素 AmpicillinAM10霉当测试革兰氏阴性肠内细菌1314-1617素当测试匍萄球菌2829类当测试肠球菌1617及奥格门丁 Amoxicillin/Clavulanic AcidAMX/CA20/10其当测试匍萄球菌属19-20复合剂当测试其他细菌1314-1718头头孢唑啉 CefazolinCZ301415-1718孢头孢三嗪 CeftriaxoneCRO301314-2021类头孢噻吩 CephalothinCF301415-1718头孢美唑 CefmetazoleCME301213-1516四环素四环素 TetracyclineTE301415-1819类强力霉素 DoxycyclineDO301213-1516大环红霉素 ErythromycinE151314-2223内酯类柱晶白霉素 LeucomycinLU151314-2223多万古霉素 VancomycinVA30肽当测试肠球菌1415-1617类当测试革兰氏阴性细菌910-1112磺磺胺甲基异恶唑 SulfamethoxazoleSMX3001213-1617胺类复方新诺明Sulfamethoxazole/TrimethoprimSXT23.75/1.251011-1516呋喃呋喃妥因 NitrofurantoinFT3001415-1617类痢特灵 FurazolidoneFR3001415-1617喹萘啶酸 Naidixic AcidNA301314-1819诺诺氟沙星 NorfloxacinNOR101213-1617酮环丙沙星 CiprofloxacinCIP51516-2021类氧氟沙星 OfloxacinOFL51213-1516碳青霉亚胺配能IMI101314-1516烯类Imipenem细菌分离培养与鉴定程序1. 基本要求:细菌分离培养的全过程需在严格无菌的条件下进行。既要防止外界细菌污染病原菌, 又要防止病原菌污染周围环境。2. 分离培养:2.1 用无菌刀或剪切开病变部位，取其切面或用无菌棉拭取病料触抹四种平板培养基营养琼脂（NA）、血液琼脂（BA)、麦康凯琼脂（Mac)、高盐甘露醇琼脂（MSA)面，并用接种环划线，放置在37恒温箱中培养18-24小时。2.2 在接种固体培养基的同时，接种四硫磺酸钠亮绿增菌液（TTB）（VTTB:V病料）=10:1)，置37恒温箱中培养18-24小时，取TTB培养物划线接种Mac平皿，置同样条件下培养以分离沙门氏菌。2.3 取平皿培养基上的菌落转接于适宜培养基表面，置3718-24小时做纯培养，以便做进一步的检查。2.4 对于可疑厌氧菌或其它有特殊条件要求的细菌（如嗜血杆菌）感染的病料，要满足相应的条件要求做病原的分离培养。3.鉴定：3.1 在做病原的分离培养的同时，取病料涂片，做革兰氏染色，和/或瑞氏染色，和/或姬姆萨染色，用光学显微镜观察细菌的形态特性。3.2 取纯培养物做上述同样的染色，用同样的方法观察细菌的形态特性。如果病料中的细菌与纯培养物的形态特性一致，可确定该纯培养为病料中的细菌。3.3 观察细菌在固体培养基上的生长特性及菌落形态特性。对某些细菌（如多杀性巴氏杆菌），还应打开培养基平皿盖闻味，检查是否有特殊的气味产生。3.4 结合临床病变、细菌的染色特性、细菌在培养基上的生长特性、溶血性等，可初步鉴定细菌的种类。必要时需做一系列的生化试验和血清学试验，对分离菌做详细的鉴定。细菌和霉菌一：孵化厅细菌监测技术 1.种蛋表面的细菌检验： （棉试子涂擦检验法） 1.1.准备工作:培养基及器械(皿)数量的准备应根据送检计划事先进行，凡与被检样品 直接接触的物品:平皿、吸管、生理盐水等，必需经过高压灭菌处理及紫外线消毒。 1.1.1 培养基: A:营养琼脂培养基(NA.) 、 B:麦康凯琼脂培养基(Mac.)、 C:高盐甘露醇琼脂培养基(MSA.)、D:霉菌琼脂培养基(MM)、 E:沙门氏志贺氏琼脂培养基(S.S)、 F:四硫磺酸钠增菌液(TTB.)、 G:三糖铁琼脂斜面培养基、 H:赖氨酸铁琼脂斜面培养基、 I:尿素及其它常见生化试验管、 I:沙门氏菌属血清、 1.1.2 器械(皿): A.水浴锅:向水浴锅内加入纯净水适量,温度调至55。 B.干热消毒的2毫升吸管、10毫升吸管、平皿。 C.其他:灭菌盐水、液泵、记号笔、试管架、塑料桶等。 1.2.检验: 1.2.1 登记、编号: 化验室接到样品后，首先根据送检单对其进行清点和簦记。同时将所有样品进行统一化验编号,并用记号笔标记在相应的试管上，并依次排在试管架上。 1.2.2操作人员必须双手消毒、更换工作服、鞋、帽、戴口罩进入无菌室。 1.2.3 稀释: 在无菌室内将全部试管盖儿打开,每管内加入4毫升灭菌盐水,浸泡5-10分钟。 1.2.4 标号: 加样前先要将棉拭子的编号标记在平皿上,每个棉拭子使用四个平皿。 1.2.5 加样: 用2毫升吸管在浸有棉拭子的试管中反复吸打使之均匀，然后吸取2毫升稀释液，分别加入对应编号的四个平皿内,每个平皿0.5毫升。 1.2.6 分组:加样完毕,要将全部平皿分成四组放置，使每组的编号完全一样，即每个棉拭子占用的四个平皿各为一组。 1.2.7 倾注培养基: 将水浴锅中冷却到48-52的NA、Mac、MSA、MM四种液体培养基分别倾注到四组平皿中，每种培养基倾注一组，每个平皿15毫升，倾注后摇匀冷却。 1.2.8 培养:待凝固后倒置于37恒温箱中培养。 1.3. 沙门氏菌属的检验: 1.3.1将试管中的2毫升液体连同拭子加入盛有20ml四硫磺酸钠亮绿增菌液（TTB）的三角烧瓶中，置于37恒温箱内增菌24小时。 1.3.2取增菌液一环划线接种于沙门氏志贺氏琼脂培养基(SS)板上，然后将其置于37恒温箱内继续培养。观察其菌落形态是否有可疑沙门氏菌落,若有无色半透明;产硫化氢菌株有的菌落中心带有黑色,即为沙门氏可疑菌落。如无典型可疑菌落应再继续培养24小时。 1.3.3 筛选试验: 在沙门氏志贺氏琼脂平板至少应选出2个典型或可疑沙门氏菌落分别接种于尿素试管培养基中并穿刺、划线于三糖铁琼脂培养基试管中.(为了防止遗漏,一般应多挑几个菌落进行培养)于37恒温箱中培养24小时(必要时可延长止48小时)观察其菌落形态及生化反应。 表1 三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶培养基筛选 三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶初步判断斜面底层产气硫化氢KA+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属KA+(-)+(-)_可疑沙门氏菌属 表2 三糖铁琼脂和尿素酶琼脂筛选 三糖铁琼脂尿素酶琼 脂初步判断斜面底层产气硫化氢KA+(-)+(-)_可疑沙门氏菌属AA+(-)+(-)_可疑亚-利桑那菌属 注：K:产碱; A: 产酸; : 阳性反应 :阴性反映 (): 少见反应: 1.3.4 生化试验: 1.3.4.1将符合表1表2可疑沙门氏菌属的三糖铁琼脂及尿素培养特性的应再进一 步做生 化试验及沙门氏菌属的因子血清鉴定试验。按表3进行生化试 表3. 沙门氏菌属生化反应 序号生化项目沙门氏菌反应1尿素酶试验2VP试验3赖氨酸脱羧酶试验4吲哚试验5丙二酸钠试验6卫矛醇试验反应不定 1.3.4.2 所有生化试验管均于37培养24小时。 1.3.5 生化试验结果符合表3沙门氏菌特性的按1.3.6进行。 1.3.6血清学鉴定试验: 1.3.6.1检查培养物有无自凝性 在洁净的玻片上加一滴生理盐水,将待检培养物混合于生理盐水滴内,使其成为均一性的浑浊悬液,将玻片轻轻摇动,在黑色背景下观察其凝集反应。如菌体 彼此相凝集成明显或较明显的小颗粒状物，即可认为有自凝性。反之无自凝性。 1.3.6.2用沙门氏诊断血清做进一步的血清学鉴定. 对无自凝性的培养物,先以多价“O”血清代替生理盐水,在2分钟内判断 结果。 如为阳性结果以单“O”血清进一步进行分群试验。 1.4.结果判定: 1.4.1 菌落计数: 培养24小时后取出营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、霉菌琼脂培养基、高盐甘露醇琼脂培养基。营养琼脂培养基记数所有菌落为总菌数；麦康凯琼脂培养基记数粉红色菌落数，通过生化鉴定大肠杆菌；霉菌琼脂培养基置于室温下再经过24小时记数霉菌数。不同的曲霉分生孢子的颜色不一样,有黄、兰、青、黑绿、棕等色；镰孢酶的菌丝有隔,产生在菌丝孢子上的分生孢子,大分生孢子呈镰刀状,有的呈豆角状。和高盐甘露醇琼脂培养基也置于室温下经过24小时后观察其菌落形态，对培养基上长出的圆形、光滑、隆起的金黄色菌落,染色镜检鉴定葡萄球菌。每一平板上的菌落数乘以8即为每个棉试子的含菌量。 1.4.2 检验标准: 总菌数 60个/枚 大肠杆菌: 0 沙门氏菌: 0 萄葡球菌: 0 霉菌: 02空气中细菌的检验： 2.1采样:见样品采集方法中孵化厅空气样品一项: 2.2.结果判定: 2.2.1 菌落计数: 培养24小时后取出营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、霉菌琼脂培养基、高盐 甘露醇琼脂培养基。营养琼脂培养基记数所有菌落为总菌数；麦康凯琼脂培养基记数红色菌落数，通过生化鉴定大肠杆菌;霉菌琼脂培养基置于室温下再经过24小时记数霉菌数；高盐甘露醇琼脂培养基也置于室温下经过24小时后观察其菌落形态，对培养基上长出的圆形、光滑、隆起的菌落染色镜检鉴定葡萄球菌。 2.2.2 检验标准: A: 总菌数 30 B: 大肠杆菌 5 C: 沙门氏菌 0 D: 霉 菌 2 E: 葡萄球菌 23 工作间表面及设备表面检验 3.1.准备工作:培养基及器械(皿)数量的准备应根据送检计划事先进行，凡与被检样品 直接接触的物品:平皿、吸管、生理盐水等，必需经过高压灭菌处理及紫外线消毒。 3.1.1 培养基: A:营养琼脂培养基(NA.) 、 B:麦康凯琼脂培养基(Mac.)、 C:高盐甘露醇琼脂培养基(MSA.)、D:霉菌琼脂培养基(MM)、 E:沙门氏志贺氏琼脂培养基(S.S)、 F:四硫磺酸钠增菌液(TTB.)、 G:三糖铁琼脂斜面培养基、 H:赖氨酸铁琼脂斜面培养基、 I:尿素及其它常见生化试验管、 I:沙门氏菌属血清、 3.1.2 器械(皿): A.水浴锅:向水浴锅内加入纯净水适量,温度调至55。 B.干热消毒的2毫升吸管、10毫升吸管、平皿。 C.其他:灭菌盐水、液泵、记号笔、试管架、塑料桶等。 3.2.检验: 3.2.1 登记、编号: 化验室接到样品后，首先根据送检单对其进行清点和簦记。同时将所有样品进行统一化验编号,并用记号笔标记在相应的试管上，并依次排在试管架上。 3.2.2操作人员必须双手消毒、更换工作服、鞋、帽、戴口罩进入无菌室。 3.2.3 稀释: 在无菌室内将全部试管盖儿打开,每管内加入4毫升灭菌盐水,浸泡5-10分钟。 3.2.4 标号: 加样前先要将棉拭子的编号标记在平皿上,每个棉拭子使用四个平皿。 3.2.5 加样: 用2毫升吸管在浸有棉拭子的试管中反复吸打使之均匀，然后吸取2毫升稀释液，分别加入对应编号的四个平皿内,每个平皿0.5毫升。 3.2.6 分组:加样完毕,要将全部平皿分成四组放置，使每组的编号完全一样，即每个棉拭子占用的四个平皿各为一组。 3.2.7 倾注培养基: 将水浴锅中冷却到48-52的NA、Mac、MSA、MM四种液体培养基分别倾注到四组平皿中，每种培养基倾注一组，每个平皿15毫升，倾注后摇匀冷却。 3.2.8 培养:待凝固后倒置于37恒温箱中培养。 3.3. 沙门氏菌属的检验: 3.3.1将试管中的2毫升液体连同拭子加入盛有20ml四硫磺酸钠亮绿增菌液（TTB）的三角烧瓶中，置于37恒温箱内增菌24小时。 3.3.2取增菌液一环划线接种于沙门氏志贺氏琼脂培养基(SS)板上，然后将其置于37恒温箱内继续培养。观察其菌落形态是否有可疑沙门氏菌落,若有无色半透明;产硫化氢菌株有的菌落中心带有黑色,即为沙门氏可疑菌落。如无典型可疑菌落应再继续培养24小时。 3.3.3 筛选试验: 在沙门氏志贺氏琼脂平板至少应选出2个典型或可疑沙门氏菌落分别接种于尿素试管培养基中并穿刺、划线于三糖铁琼脂培养基试管中.(为了防止遗漏,一般应多挑几个菌落进行培养)于37恒温箱中培养24小时(必要时可延长止48小时)观察其菌落形态及生化反应。 表1 三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶培养基筛选 三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶初步判断斜面底层产气硫化氢KA+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属KA+(-)+(-)_可疑沙门氏菌属 表2 三糖铁琼脂和尿素酶琼脂筛选 三糖铁琼脂尿素酶琼 脂初步判断斜面底层产气硫化氢KA+(-)+(-)_可疑沙门氏菌属AA+(-)+(-)_可疑亚-利桑那菌属 注：K:产碱; A: 产酸; : 阳性反应 :阴性反映 (): 少见反应: 3.3.4 生化试验: 3.3.4.1将符合表1表2可疑沙门氏菌属的三糖铁琼脂及尿素培养特性的应再进一 步做生 化试验及沙门氏菌属的因子血清鉴定试验。按表3进行生化试 表3. 沙门氏菌属生化反应 序号生化项目沙门氏菌反应1尿素酶试验2VP试验3赖氨酸脱羧酶试验4吲哚试验5丙二酸钠试验6卫矛醇试验反应不定 3.3.4.2 所有生化试验管均于37培养24小时。 3.3.5 生化试验结果符合表3沙门氏菌特性的按1.3.6进行。 3.3.6血清学鉴定试验: 3.3.6.1检查培养物有无自凝性 在洁净的玻片上加一滴生理盐水,将待检培养物混合于生理盐水滴内,使其成为均一性的浑浊悬液,将玻片轻轻摇动,在黑色背景下观察其凝集反应。如菌体 彼此相凝集成明显或较明显的小颗粒状物，即可认为有自凝性。反之无自凝性。 3.3.6.2用沙门氏诊断血清做进一步的血清学鉴定. 对无自凝性的培养物,先以多价“O”血清代替生理盐水,在2分钟内判断 结果。 如为阳性结果以单“O”血清进一步进行分群试验。 3.4.结果判定: 3.4.1 菌落计数: 培养24小时后取出营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、霉菌琼脂培养基、高盐甘露醇琼脂培养基。营养琼脂培养基记数所有菌落为总菌数；麦康凯琼脂培养基记数粉红色菌落数，通过生化鉴定大肠杆菌；霉菌琼脂培养基置于室温下再经过24小时记数霉菌数。不同的曲霉分生孢子的颜色不一样,有黄、兰、青、黑绿、棕等色；镰孢酶的菌丝有隔,产生在菌丝孢子上的分生孢子,大分生孢子呈镰刀状,有的呈豆角状。和高盐甘露醇琼脂培养基也置于室温下经过24小时后观察其菌落形态，对培养基上长出的圆形、光滑、隆起的金黄色菌落,染色镜检鉴定葡萄球菌。每一平板上的菌落数乘以8即为每个棉试子的含菌量。 3.4.2 检验标准: 总菌数 32 大肠杆菌: 8 沙门氏菌: 0 萄葡球菌: 8 霉菌: 84水样的检验： 4.1.检验内容. 4.1.1 细菌学方面:主要检查水中的大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、霉菌以及总的细菌含量。 4.2.准备： 4.2.1 培养基: A:营养琼脂培养基(NA.)、 B:麦康凯琼脂培养基(Mac.)、 C:高盐甘露醇琼脂培养基(MSA.)、 D:霉菌琼脂培养基(MM.)、 E:沙门氏志贺氏琼脂培养基(S.S)、 F:四硫磺酸钠增菌液(TTB.)、 G:三糖铁琼脂斜面培养基、 H:赖氨酸铁琼脂斜面培养基、 I:尿素及其它常见生化试验管、 I:沙门氏菌属血清、 4.2.2 器械(皿): A.干热消毒的18mm180mm玻璃试管、2毫升吸管、10毫升吸管、直径90mm平皿等。 B.水浴锅:向水浴锅内加入纯净水适量,温度调至55。 C.其他:灭菌并加塞的250毫升玻璃采水瓶、灭菌盐水、液泵、记号笔、试管架、塑料桶等。 4.3.检验: 4.3.1 登记、编号:化验室接到样品后，首先根据送检单进行清点，同时将所有样品进行统一化验编号,并用记号笔标记在相应的送检水瓶上。 4.3.2 标号:稀