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生物技术制药生物技术：是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品为社会服务的综合性的技术体系。生物技术的主要内容基因工程 细胞工程 发酵工程 酶工程此外还有 基因诊断与基因治疗技术、 克隆动物技术、生物芯片技术、 生物材料技术、生物能源技术、 利用生物降解环境中有毒有害化合物的技术对人类社会影响最大的生物技术领域：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术蛋白质工程的主要步骤通常包括*：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构；（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白质的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。现代酶工程的主要内容*：a、酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；b、酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测；c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；e、有机相中酶反应的研究；f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；g、抗体酶、核酸酶的研究；h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。生物技术的发展简史传统生物技术（远古-20世纪30年代）近代生物技术（1943-1978）：以青霉素产业化为标志，至DNA体外重组技术诞生。现代生物技术：DNA互补双螺旋结构模型，发现mRNA，遗传密码的破译，限制性内切酶，DNA测序，DNA重组技术，PCR方法，人类基因组草图 生物药物分类按照来源分为4大类： a.基因重组多肽、蛋白质类治疗剂 b.基因药物 c.天然生物药物 d.合成与部分合成的药物 按照功能分为3大类： a.治疗药物 b.预防药物 c.诊断药物生物技术药物的特征分子结构复杂具有种属特异性治疗针对性强、疗效高稳定性差基因稳定性免疫原性体内的半衰期短受体效应多效性和网络性效应检验的特殊性生物技术制药的特征高技术 (精细和密集的复杂技术)高投入 (尤其是前期科研投入高)长周期 (参考我国药物研发和注册程序)高风险高收益生物技术在制药中的应用基因工程制药：疫苗、抗体等细胞工程制药：动物细胞工程和植物细胞工程发酵工程制药：微生物药物酶工程制药：酶的催化和微生物转化基因工程克隆载体的特点：具有复制子有单一限制内切酶切位点或多克隆位点有选择性遗传标记如抗性基因拷贝数高生物安全性好目前使用的载体按特性可分为： 质粒 噬菌体 黏性质粒 M13噬菌体 酵母 真核细胞病毒载体质粒：是存在于细菌等微生物细胞染色质以外的共价闭环的双股DNA分子，具有独立自主复制和调控能力，可赋予宿主细胞一定的生物性状。真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件载体能够独立复制。载体本身是一个复制子，具有复制起点。应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。应具有很强的启动子，能为大肠杆菌 RNA聚合酶所识别。应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。基因工程 (genetic engineering)*： 有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。基因工程药物的主要类别1.激素：胰岛素，生长激素2.免疫性蛋白：单克隆抗体，疫苗3.细胞因子：干扰素，白细胞介素4.酶类：尿激酶，超氧化歧化酶基因工程生产药物的优点1.收获量大，更有效服务社会。2.生产效率更高3.进一步改良药理活性，例：蛋白质工程4.有利于获得新药：筛选新型化合物目的基因的获得1. 构建cDNA文库，然后从中调用目的基因；2. 聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因片段；3. RT-PCR(反转录-PCR)合成目的DNA片段4. 对旧基因的改造5. 化学合成（短）基因宿主菌的必要条件:1. 具有高浓度、高产量、高产率2. 利用廉价原料3. 不致病、不产生内毒素4. 发热量低、需氧低、发酵温度适当5. 易于代谢调控6. 易于DNA重组7. 产物分离纯化简单 常见的宿主菌原核细胞：大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌真核细胞：酵母、丝状真菌大肠杆菌中的外源基因表达1. 真核基因在大肠杆菌表达载体的必备性质2. 表达载体pBV220 & pET system3. 影响目的基因表达的因素4. 真核基因在大肠杆菌的表达形式E.coli 表达载体的6个必备性质1.独立的复制子2.多克隆位点3.强启动子4.强终止子5.阻遏子6.Shine-Delgarno sequence（SD 序列） & AUG影响目的基因在E.coli表达的5大因素1.基因的剂量2.表达效率 a 转录的强度， b 翻译效率（核糖体结合，SD序列，condon bias：密码子偏爱）3.表达产物的稳定性:4.宿主E.coli的代谢负荷5.工程菌的培养条件真核基因在 E.coli 表达形式 以融合蛋白的形式表达药物基因融合蛋白：以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。（与原核多肽使用同起始密码和终止密码） 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，可高效表达； 缺点：只能作抗原用。 以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白：在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点：保持原有蛋白活性； 缺点：易被蛋白酶破坏。分泌型表达药物基因 优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基，易于分离纯化。 缺点：产量不高， 信号肽不被(在特定位置)切割。以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：a获得目的基因和质粒载体；b形成重组质粒；c制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；d培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；e筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。酵母体系中的基因表达载体：A. 酵母载体类型YEp（yeast episomal plasmid,酵母附加体质粒）YRp（yeast replicating plasmid,酵母复制型质粒）YCp（yeast centromeric plasmid,酵母着丝粒质粒）Yip （yeast integrativeplasmid,酵母整合性质粒）B. 克隆载体与穿梭载体影响目的基因在酵母表达的因素1.外源基因的剂量2.外源基因的表达效率 启动子的来源 终止子的有效性 分泌信号的效率3.外源蛋白质的糖基化4.宿主菌株的影响生长能力、内源蛋白酶、菌株性能、分泌能力基因工程药物生产路线（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受 体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。（6）分离纯化产物、除菌过滤、鉴定、包装乙酸是怎么产生的生物体的代谢：合成代谢（需要能量）、分解代谢（释放能量）生物体获得能量的途径*： 1.呼吸作用所产生的ATP 2.TCA循环（柠檬酸循环）产生的ATP 乙酰辅酶A为TCA循环的起止点 3.辅助形式：乙酰-CoA 乙酸 + ATP控制乙酸产生的方法1. 分批培养：选择不同的碳源2. 补料培养：控制补料速度3. 连续培养：控制稀释速率4. 加入蛋氨酸（提高菌体有氧代谢能力）和酵母提取物（减少葡萄糖的摄取）实质：控制菌体的糖酵解（EMP）速度，使之低于TCA循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生。菌体生长与前体供应的关系前体*：细胞从外界吸收的或在代谢途径中形可被进一步转变成大分子产物的化合物。 基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，导致工程菌生长速率降低。质粒存在对菌体代谢的影响中等拷贝质粒（56拷贝）：与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。高拷贝质粒（240拷贝）：生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生的“严紧反应”有关。基因工程菌的不稳定性 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性。 质粒不稳定可分为*： 分裂不稳定、结构不稳定分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。即整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。一、质粒不稳定产生的原因*常见分裂不稳定的两个因素：与宿主菌、质粒特征和培养条件有关。含有与不含质粒的两种菌比生长速率差异的大小。即丢失质粒的菌体在非选择性培养基中一般具有生长优势，在培养中会逐渐取代质粒菌而成为优势菌。常见结构不稳定的因素：1.质粒自发缺失与质粒中短的正向重复序列之间的同源重组有关，具有两个串联启动子的质粒更容易发生缺失；2.在无同源性的两个位点之间也会发生缺失；3.培养条件也会对质粒结构不稳定产生影响。二、提高质粒稳定性的方法1、选择合适的宿主菌 宿主菌的遗传特征 宿主菌的比生长速率 基因重组系统的特征 染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列2 选择合适的载体 载体的拷贝数 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高，增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低，但对稳定性不利。对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数。3 选择压力 在培养基中加选择性压力抗生素，可以抑制质粒丢失菌的生长。添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力。大规模生产时不可取。4 分阶段控制培养 第一阶段先使菌体生长至一定的密度，使质粒稳定地遗传，第二阶段诱导外源基因的表达，由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。 5 控制/优化培养条件 通过调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度、限制性营养物质来控制比生长速率。6 固定化 不同的宿主菌及其质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。 基因工程菌中试中试是以实验室研究（上游）为基础，为大量生产（下游）铺垫的阶段。 中试的目的：1. 临床试验2. 摸索大量生产的条件/参数中试应考虑的问题一、工程菌选择二、发酵罐设计三、发酵培养基组成四、工艺最佳化与参数（主要参数、生物量、碳源、产品）监测控制五、计算机的应用六、产品提取和纯化基因工程菌的培养方式分批培养:为了保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。补料分批培养:补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法连续培养: 将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境。透析培养:利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响固定化培养:将细胞限定或固定在一定的空间内，可以提高工程菌的稳定性，提高质粒的稳定性，便于进行连续培养。最佳化工艺的综合指标最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。基因工程菌对发酵罐的特殊要求提供菌体生长最适生长条件，培养过程不得污染，保证纯菌培养，培养及消毒过程不得游离出异物，不能干扰细菌代谢活动等。高密度发酵：指培养液中工程菌的菌体浓度在50g DCW/L以上，理论上的最高值可达 200g DCW/L。(DCW: dry cell weight)单个菌株的外源基因表达量不变高密度发酵的意义降低生产成本、提高生产效率提高发酵罐内的菌体密度提高产物的细胞水平量相应的减少了生物反应器的体积提高单位体积设备生产能力降低生物量的分离费用缩短生产周期影响高密度发酵的因素培养基；溶氧浓度； pH；温度；代谢副产物1 培养基:高密度发酵对基质中营养源的种类和含量比要求较高。如碳源和氮源的比例：偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；偏大，则菌体繁殖数量少，细胞代谢不平衡，不利于产物积累。2 溶氧浓度 菌体在扩增过程中，需要大量氧进行氧化分解代谢，饱和氧的及时供给非常重要。 随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧浓度随之下降，细胞的生长减慢。特别是高密度发酵的后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐各项物理参数均不能满足对氧的供给，导致菌体生长极为缓慢，外源蛋白的表达量也较差。在发酵过程中保证适宜的溶氧浓度，必须确定发酵罐的通气量和搅拌速度3 pH 大肠杆菌利用葡萄糖产酸产气，特别是大量的乙酸和二氧化碳，使pH降低，必须调节pH在适宜的范围。4 温度培养温度在适宜的范围，对于温控诱导表达的基因工程菌来说，诱导时机和持续时间对于重组蛋白的产量有很大影响。5 代谢副产物 乙酸 ；二氧化碳为降低培养基中代谢副产物的积累，可采用流加补料的措施，或保持适当的比生长速率，或在培养基中添加某些氨基酸。实现高密度发酵的方法1 发酵条件的改进培养基的选择：采用甘油作为碳源建立流加式培养：营养过高抑制细胞生长，高密度发酵是以低于抑制阈的浓度开始的，营养物是在需维持高生长速率是才添加的。提高供氧能力：通入空气与氧混合气体；增加压力；发酵液中添加过氧化氢。2 构建产生乙酸化能力低的工程化宿主菌通过发酵条件的改进可以减少乙酸的产生，但是难以做到精细的调控，通过切断细胞代谢网络上产生乙酸的生物合成途径，构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从根本上届均问题的途径之一。阻断乙酸产生的主要途径：基因敲除或突变产生乙酸代谢突变菌株。对碳代谢流进行分流：丙酮酸代谢有选择的向乙醇的方向进行。限制进入糖酵解途径的碳代谢流：大肠杆菌对葡萄糖的摄取是在磷酸转移酶系统的作用下通过基团转位的方式进行的，通过基因敲除法限制葡萄糖的摄取速率。引入血红蛋白基因：提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率。3 构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋白而言，随着发酵后期各种蛋白水解酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解酶的作用而被降解。基因工程药物或生物技术产品特点:(1) 目的产物在初始原料中的含量较低;(2) 含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；(3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感,容易失活、变性；(4) 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质；(5) 应用面广，对其质量、纯度要求高甚至要求无菌、无热源。分离纯化的技术要求（1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；（2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；（3）收率要高；（4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤；（5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求分离纯化工艺应遵循的原则1）具有良好的稳定性和重复性；2）尽可能减少组成工艺的步骤；3）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺和设备相适应4）在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量；5）分离纯化工艺所用的时间尽可能短，尤其是对稳定性差的产物；6）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件要求低，能耗低；7）具有较高的安全性。细胞的破碎方法物理法：匀浆法,利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀后，因高速撞击和突然减压而使细胞破裂的方法。(可以大规模应用,不适用于易造成堵塞的团状或丝状真菌”)珠磨法，将细胞悬浮液与研磨剂一起快速搅拌或研磨，利用玻璃珠间以及玻璃珠与细胞间的相互剪切、碰撞促进细胞壁破裂而释放出内含物。(产生大量的热，必须采取冷却措施)超声法，利用超声波来处理细胞悬浮液，在超声波作用下，液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。（可处理少量样品，产生热量大，敏感物质易失活。）化学法：渗透冲击，先将细胞置于高渗透压介质，达成平衡后，突然稀释介质，在渗透压的冲击下，使细胞壁和膜膨涨破裂。（适用于细胞壁较脆弱的，经过酶处理的细胞壁。）增溶法，利用表面活性剂等化学试剂的增溶作用，增加细胞壁和膜的通透性使细胞破碎的方法。（表面活性剂：SDS；TritonX-100，有机溶剂：乙醇；异丙醇，尿素、EDTA）生物法：酶溶法，利用生物酶消化溶解细胞壁和细胞膜的方法。（细胞壁溶解酶是几种酶的复合物，必须根据待处理细胞的结构和化学组成来选择适当的酶，并确定相应的使用次序。）价格高，回收利用困难，仅在实验室用。凝胶层析指化合物随流动相流经装有凝胶的固定相的层析柱时，因其各种物质分子大小不同而被分离的技术。又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析。优点：设备简单，操作方便，分离效果好，回收率高，分离条件缓和，不使活性物质失活变性，凝胶可重复使用，无需再生处理。缺点：分离速度慢。包含体： 是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。包含体对于重组蛋白的产生的优势1、富集目标蛋白：包含体具有高密度，易于分离纯化的优势；2、抗蛋白酶：重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解；3、对宿主毒性小：生产那些处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。（但是，其复性率低！）包含体的溶解一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包含体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。或用去垢剂，如SDS、TritonX-100、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包含体蛋白质。生物活性测定需通过动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定产品的保存防止变性，降解，保护其活性中心。液态保存（1）低温保存：液态蛋白质样品在-10-20C以下冰冻保存。（2）在稳定pH条件下保存：蛋白质较稳定的pH一般在等电点，且多数蛋白质只有在很窄的pH 范围内才稳定。因此对保存液态蛋白质样品时小心调到其稳定的PH 范围内。（3）高浓度保存：一般蛋白质在高浓度时比较稳定，因为液态蛋白质容易受水化作用的影响，浓度太低易引起亚基解离和表面变性。（4）加保护剂保存：多元醇、有机溶剂、巯基乙醇、二硫苏糖醇等。固态保存：一般蛋白质含水量超过10%时容易失活。含水量降到5%时，在室稳或冰箱中保存均比较稳定，但在37 保存时活性明显下降。长期保存蛋白质的最好方法是制成干粉或结晶。冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定性，放在干燥器中在4可保存相当长的时间。离体培养的细胞分为两类：1、贴壁细胞：细胞生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。（Hela细胞；巨噬细胞；神经细胞）2、悬浮细胞：生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。细胞为圆形。（淋巴细胞；血液白细胞）3、兼性贴壁细胞：生长不严格依赖支持物。形态：上皮样，成纤维样，圆形（中国地鼠卵巢细胞；小鼠L929细胞）融合细胞系细胞融合：两个或者两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。融合细胞：动物+动物；动物+植物融合方法：仙台病毒融合法；聚乙二醇融合法；电融合法基因载体导动物细胞常用方法：磷酸钙沉淀法：溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。电穿孔法 ：借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。动物细胞培养基的种类和组成1、天然培养基：血清、羊水、腹水等。（成分复杂、成分不稳定。）2、合成培养基：明确的化学试剂配置成，适于重复实验。（DME、MEM、DMEM、HAM F12、RPMI1640）合成培养基成分：氨基酸：至少12种（胱），型。维生素：辅酶或辅基糖类：能量无机盐：保持渗透压其它成分：添加小牛血清添加小牛血清的作用：提供生长因子和激素提供贴附因子和伸展因子提供可识别金属、激素和维生素的结合蛋白提供必需脂肪酸和微量元素提供良好的pH缓冲系统。3、无血清培养基提高重复性减少微生物污染供应充足稳定产品易纯化避免血清因素对细胞的毒性减少血清中蛋白对生物测定的干扰无血清培养基加入的添加剂种类：生长因子和激素结合蛋白贴附因子和伸展因子有利细胞生长的因子和元素悬浮培养（suspension culture） 让细胞自由地悬浮于培养基内进行生长繁殖。适用细胞类型：一切种类的非贴壁依赖性细胞，兼性贴壁细胞。设备：通气搅拌式生物反应器、气升式生物反应器。生产药物：单克隆抗体；干扰素。优点：操作简单，培养条件均一，传质和传氧效果好，容易大规模培养。缺点：细胞体积小，且处于悬浮状态，难采用灌流培养，细胞密度低。贴壁培养必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用细胞类型：一切贴壁依赖型细胞，兼性贴壁细胞。基质要求：具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密度。优点：A 容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表 面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。B 容易采用灌流培养，从而达到提高细胞密度的目的，因细胞固定表面，不需过滤系统。C 当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。 D 适用的细胞类型范围广。 缺点：A 操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足 够的面积。B 培养条件不易均一，传质和传氧效果差。C 不能有效地监控细胞的生长。贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养将悬浮培养和贴壁培养相结合的方法。微载体培养：创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖；载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当（1.0301.045g/ml）、粒径均一，在60250mm之间（溶胀后）、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分。80年代以后发展的多孔微载体或多孔微球包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。可用于包埋细胞的载体材料为：人工合成的高分子聚合物；糖类如纤维素等；蛋白质如胶原、纤维蛋白等。包埋法：将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法。优点：步骤简单， 条件温和， 负荷量大， 细胞泄露少， 抗机械剪切。缺点：扩散限制，并非所有的细胞处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。一般适用于非贴壁依赖性细胞的固定。常用的载体：琼脂糖；海藻酸钙凝胶结团培养：利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了用于微载体的成本。动物细胞培养的操作方式1、分批式操作将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。2、半连续式操作当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。3、灌流式操作当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。细胞被固定，在取出部分条件按培养基和补充新鲜培养基时，细胞基本上都被保留在反应器内。抗 体 制 药抗体：是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。抗原：是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞结合，发生免疫效应的物质。多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。 单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的抗体。抗体药物的特异性1.与相关抗原的特异性结合2.对肿瘤靶细胞的选择性杀伤3.在动物体内呈靶向性分布4.对相关的肿瘤显示更强的疗效单克隆是指所有制备抗体的细胞都是同一个细胞的拷贝，因此其产生的抗体完全相同。单克隆抗体是大规模细胞培养的产物，而不是直接来自于动物血清。制备单克隆抗体的过程涉及到细胞培养、细胞融合等多种步骤。免疫的方法：体内免疫法 体外免疫法 体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用812周龄雌性鼠。细胞融合的方法：A、PEG融合法 脾细胞（1108） 骨髓瘤细胞（2-3107）混合 聚乙二醇（ PEG）诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。B电融合法 优点：不存在对细胞的毒害问题； 融合效率高； 融合技术操作简便。 筛选阳性克隆与克隆化 筛选阳性克隆常用检测方法： 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。这种群体细胞的生物学特性和功能完全相同。常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂培养法体外培养法可获得10m/ml的抗体。多采用RPMI 1640培养液，添加10%20%胎牛或小牛血清。培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100m/ml以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。动物体内诱生法可获得10m/ml的抗体。基本程序：接种前12周，小鼠腹腔注0.5ml Pristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1106杂交瘤细胞，712d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。单克隆抗体的纯化根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。1.体外诊断试剂IgG类-沉淀处理+亲和层析2.IgM类-沉淀处理+凝胶过滤3.体内诊断试剂或治疗用药-亲和层析+阴离子交换层析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。鼠源性单克隆抗体的改造目的：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。基因工程抗体的优点：1.最大成度降低抗体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反应2.分子较小，穿透力强，更易到达病灶的核心部位3.可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体4.可以采用原核细胞、真核细胞或动植物等多种表达系统大量生产，大大降低成本。小分子抗体类型有(1) Fab片段抗体：VH+CH1(2) FV抗体：VH+VL(3)单链抗体：VH-Linker-VL (4)单域抗体：VH或VL(5)最小识别单位: CDR单链抗体大多在大肠杆菌中表达，有三种形式：直接在细胞质中表达；与其它菌体融合表达融合蛋白；分泌表达具有功能的单链抗体。单链抗体的优点：1.可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。2.易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度。3.免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应。4.在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;5.易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。缺点：稳定性地、功能单一、亲和力低单域抗体：即为VH/VL，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。 双特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。一种为对应肿瘤相关抗原，另一种为对应效应成分。 即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。构建双功能抗体的方法：主要依据：连接肽1.非共价键2.共价键3.Leu zipper、helix-turn-helix motif etc.抗体融合蛋白广义属双功能抗体。类型： 配基-配基型融合蛋白； 配基-Ig型嵌合蛋白； 配基-Fv型融合蛋白； 受体-Fv型融合蛋白； 酶-抗体型融合蛋白；抗体研究进展3个阶段：1890年白喉抗毒素，多克隆抗体；1975年杂交瘤技术单克隆抗体；1994年基因工程抗体；抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。噬菌体抗体库技术的基本方法1、获取目的基因：提取RNA，经RT-PCR获取抗体 某一特定基因区段。2、抗体库技术的载体：普遍使用噬菌（phagemid）载体。3、淘筛（panning）：用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量扩增。4、表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感 受态菌珠，进行可溶性表达，其产物用Westernblot 分析确定后，就完成了全过程。噬菌体表面展示文库技术的要点: 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段随机克隆入相应载体形成组合文库将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。噬菌体抗体库技术的特点 模拟天然全套抗体库 避开了人工免疫和杂交瘤技术 可获得高亲和力的人源化抗体基因工程抗体表达1、原核细胞表达：2、真核细胞表达：酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞、真菌等。3、转基因植物表达：烟草叶和拟南芥植物。其产量可达叶片总蛋白量的1.3%。4、转基因动物表达：单基因水平上做转基因鼠。乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂A试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗HBs血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。反向被动血凝试验（RPHA）：用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原的方法。B.试剂制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠-获得抗HBs血清-硫酸铵盐析/柱层析-取其IgG -在pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞-洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。C.诊断方法：反向被动血凝试验RPHA（reverse passive hemagglutination)法在V型血凝板上进行。阴性样品不凝集，血细胞沉积于V型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。免疫酶抗体诊断试剂免疫酶染色法用抗体诊断试剂酶免疫测定用抗体诊断试剂HBsAg（乙肝表面抗原）酶标诊断试剂HBeAg（乙肝病毒e抗原）酶标诊断试剂HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊断试剂测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标抗体诊断试剂甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊断试剂癌胚抗原（CEA）的酶标抗体诊断试剂常用的标记抗体试剂：a、HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度0.1 ng/mlb、HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂： 125I 标记，灵敏度0.1 ng/mlc、HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂： 125I 标记d、AFP放射性核素标记抗体诊断试剂： 125I 标记，灵敏度15 ng/mle、CEA放射性核素标记抗体诊断试剂： 125I 标记，灵敏度1 ng/ml植物细胞工程：以植物细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为地精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种、加速繁殖植物或获得有用物质的技术。外植体：是指用于植物组织细胞培养的器官或组织的切段，植物的各个部位如根、茎、叶、花、果等均可以作为外植体进行培养。植物的各个部分凡是能培养后成长成一颗植株的都是外植体。愈伤组织：植物局部创伤后或者在组织培养中，当已经分化的细胞恢复了细胞分裂能力，而增殖形成的无组织，无器官分化的薄壁细胞团。次级代谢和次级代谢物：它是相对于初级代谢物而言，一般指对生物体没有明确的生理功能，是生命的多余成分。次级代谢物多是生物药物。 细胞再分化（redifferentiation)： 脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体的过程。极性：是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。质体：是一类与碳水化合物的合成与贮藏密切有关的细胞器。根据色素的不同分为叶绿体、有色体，白色体。其中叶绿体是光合作用的质体。所以说植物是光能自养型的生物。能源来源于光能，碳源来源于二氧化碳。二步培养法植物培养细胞的重量的增加主要是取决于对数期。而次级代谢产物的累积主要在稳定期。由此产生了二步培养法，即先让植物细胞进行大量的生长，然后诱导形成大量的次级代谢产物。第一步主要使用适合细胞生长的培养基，称为生长培养基，第二步主要适用于次级代谢产物和合成的培养基，称为生产培养基。 诱导子：植物抗病生理过程中诱发植物抗毒素和引起植物过敏反应（亦称抗性反应或自身防御反应）的因子，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。生物诱导子：植物在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质。非生物诱导子：所有不是植物细胞中天然成分又能促发植物细胞形成抗毒素信号的物质。两相法培养两相法培养的基本出发点是在细胞外创造一个次级代谢产物的储存单元。该培养方法可以加入固相或疏水液相，形成两相培养系统，从而达到收集分泌物的目的。 优点：该法可减轻产物本身对细胞代谢的抑制作用，并可保护产物免受培养基中催化酶或酸对产物的影响。此外，由于产物在固相或疏水液相中的积累简化了下游处理过程必须满足如下条件：添加的固相（如树脂）或液相对细胞无毒害作用，不影响细胞生长和产物的合成；产物易被固相吸附或被有机相溶解；两相易分离；如为固相，不可吸附培养基中的添加成分，如植物生长调节剂、有机成分等前体及诱导子的作用加入前体物质可以减弱限速酶的作用，促进次生代谢物的合成。例如：苯丙氨酸；酪氨酸。酶的特性酶是由活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质。其特点：催化效率高专一性强反应条件温和催化活性受到调节和控制酶工程：酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。酶法制药：利用酶的催化作用将前体物质转化为有用药物的过程，它是利用固定化酶或者固定化细胞在生物反应器中来生产药物。现代酶工程的主要内容：a、酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；b、酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测；c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；e、有机相中酶反应的研究；f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；g、抗体酶、核酸酶的研究；h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。酶的来源生物合成法：酶普遍存在于生物体内，因此可以从生物体内直接分离，工业生产一般都以微生物为主要来源，通过微生物的大规模培养发酵来获得。化学合成法：已知酶的结构和序列，利用合成肽的自动化技术来合成。理论上可以使用这种方法，但是实际上由于试剂、设备和经济条件等多种因素的限制，通过化学合成法需要相当长的时间，所以酶的生产只宜从微生物体中提取分离。目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的。其特点是：A、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎能都从微生物中得到；B、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条件来提高酶的产量；C、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌珠。对酶的生产菌菌种的要求：a、产酶量高，酶的性质符合使用要求，而且最好是产生胞外酶的菌；b、不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生毒素；c、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；d、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养固定化酶：凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用的酶。固定化细胞：指限制或固定于特定空间位置的细胞。为什么要固定化？酶稳定性差：在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。酶反应一般在水溶液中进行，反应结束后，很难对酶进行回收利用，一次性使用造成了浪费。反应后酶与产物混合在一起，对分离造成了困难。不利于连续生产，生产时间长后容易失活，或者在流加培养中造成损失。固定化酶的特点 优点：具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。可多次使用，多数情况下，稳定性提高。反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。反应条件易控制，可以实现转化反应的连续化和自动控制。酶的利用效率高。比水溶性酶更适合于多酶反应。 缺点：固定化时，酶活力有损失；增加了成本；只能用于可溶性底物，而且适合于小分子底物，对大分子底物不适宜；胞内酶必须经过酶的分离纯化过程；与完整菌体相比不适宜用于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。载体结合法： 将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。A、物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。缺点：最适吸附酶量无规律