卵黄抗体IgY在猪生产中的应用.doc

卵黄抗体IgY在猪生产中的应用摘要：卵黄抗体(Yolk Immunoglobulin，IgY)是蛋鸡受特定抗原刺激后体内会产生特异性并被转移和贮存在卵黄中的免疫球蛋白。 用鸡卵黄大量生产和制备多克隆抗体是近年来抗体制备技术中新兴的研究领域。IgY可作为替代抗生素的新型绿色饲料添加剂。本文就免疫鸡卵黄抗体在猪生产中的应用作一综述。关键词 卵黄抗体；猪生产；应用卵黄抗体作为一种新型绿色添加剂有其自身的优势：卵黄抗体产量高，Anders(1993)推算认为一只蛋鸡每周的抗体产量相当于910只小白兔的抗体产量；鸡蛋的生产成本较低，收集和提纯方便，大规模提取抗体的技术已经成熟；产生有效免疫反应所需抗原量小；IgY的化学性质稳定，具有一定的耐热、耐酸、耐碱及耐高渗性能，对胃蛋白酶具有良好的抵抗能力；由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应；不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳性结果；对肠道正常菌群无副作用，也不存在抗药性和药物残留问题。IgY本身是一种优质的蛋白源，有促生长作用。1卵黄抗体(IgY)1.1 IgY抗体结构IgY大分子的结构与哺乳动物免疫球蛋白类似。Warr等(1995)1通过分子结构分析认为IgY是哺乳动物体内IgG 和IgM 的进化前体。IgY 中C3和C4区与哺乳动物IgG 的C2和C3具有同源性；C2是IgY的枢纽区，而它在IgY 中没有得到充分进化。IgY中这种不发达的枢纽区造成了Fab部分的低活性，而这进而可能是IgG 与IgY某些差异的原因。与IgG一样，IgY的Fc片断是绝大部分生物受动器功能的作用部位。IgY-Fc部分包括2条碳氢链，而IgG 只有一条。IgG在重链上含有3个功能域而IgY的重链含有4个功能域，而且IgY缺少铰链区。1.2 IgY进入卵黄的机制 禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫，分别受胸腺和法氏囊的控制。当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgY)在卵细胞中逐渐蓄积。IgY通过受体调节作用 ，它只允许母源血液中存在的IgY选择性地向卵黄转移，转运量与其在血清中的浓度相关，该转运对不同IgY 的次级成分没有差异性。当卵细胞分泌进入输卵管时，流经输卵管的血液中含有的特异性抗体(主要是IgA和IgM)进入卵清中，形成卵清抗体。Losch(1986)证实只有少量的IgA 和IgM 经输卵管从血细胞转运到鸡蛋白部分。2 卵黄抗体在猪生产中的应用2.1 卵黄抗体在防治仔猪腹泻上的应用2.1.1 仔猪大肠杆菌性腹泻机制仔猪大肠杆菌腹泻是产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起新生和断奶仔猪腹泻的主要致病菌之一。大肠肝菌致病因子包括：粘附素(adhension)、肠毒素(Enterotoxins)、水肿病毒素(edema disease principle,EDP)、内毒素(endotoxin)、溶血素(haemolysin)以及最近发现的EatA2。其中ETEC引起仔猪腹泻的主要致病原是具有宿主特异性的粘附素和肠毒素。ETEC粘附素实质上是一种菌毛蛋白又称为定居因子(CFAS)。Conway(1990，1991)认为与小肠黏膜上的受体结合是ETEC致病过程中的重要环节。仔猪的肠道黏膜上皮细胞表面具有多种能与ETEC特异性粘附素结合的受体。ETEC宿主特异性菌毛粘附素有20多种，引起仔猪腹泻的主要是K88(F4)、K99(F5)、987P(F5)、F41等。ETEC菌毛抗原能够识别特定受体并与之结合使菌体能够抵抗肠道蠕动产生的冲刷作用从而定植下来，大量增殖并产生肠毒素（耐热肠毒素、不耐热肠毒素、志贺毒素2e、肠管凝集耐热肠毒素）。耐热肠毒素(ST)与神经节苷脂(GM1)结合激活肠粘膜细胞表面的鸟苷环化酶(GC)，使胞内cGMP含量增多从而导致腹泻；不耐热肠毒素(LT)与GM1结合后激活肠上皮细胞的腺苷酸环化酶，使细胞中cAMP水平升高，进而导致肠粘膜细胞对水和Na+ 、Cl-、HCO3-等过度分泌至肠腔引起腹泻3。2.1.2 IgY抑制大肠杆菌菌毛粘附素与小肠黏膜受体结合的作用机制可包括一下几个方面：特定病原菌卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。Jin (1998)4用抗菌毛卵黄抗体处理后的大肠杆菌在体外与小肠上皮细胞的进行吸附试验，结果表明大肠杆菌在小肠黏液的吸附受到明显的抑制。但试验表明随着E. coli浓度的提高，抑制效果明显降低，说明lgY作用的发挥具有量依赖性。Yokoyama(1992)5将提纯的ETEC的K88、K99、987P制成单价菌毛蛋白苗，免疫蛋鸡获得卵黄抗体粉末，EIISA检测结果表明，抗K88、K99、987P的卵黄抗体能够特异性地与相应的菌毛抗原作用。用卵黄抗体对不同ETEC菌株攻毒的新生仔猪进行口服治疗，治疗组仔猪全部存活，而对照组仔猪死亡率超过80 。高云英(2003)6用ETEC的K88、K99、987P标准菌株和地方分离菌株制成多价菌体卵黄抗体经预防、攻毒试验及临床治疗效果观察，对新生仔猪免疫保护率可达90 以上，3日龄仔猪攻毒保护率达98 以上，311日龄仔猪临床治愈率达95 以上。2.1.3 影响卵黄抗体防治仔猪腹泻效果的因素 菌体与菌毛抗原。以菌体为抗原制备菌体疫苗，制作虽然方便但免疫效果不如菌毛抗原制备的菌毛蛋白苗效价高(肖驰等1998)7， 试验还显示卵黄抗体对仔猪黄痢的治愈率高于庆大霉素、土霉素和痢特灵。;卵黄抗体的剂量和ETEC的浓度。小肠内所含抗体须达到一定剂量才能阻止Ecoli粘附到小肠粘膜上皮细胞的受体上。采用卵黄抗体进行治疗应具有连续性，例如：每只仔猪每天饲喂1.5g的卵黄抗体能有效防治1010 cfumL ETEC引起的腹泻，在饲粮中添加02的卵黄抗体可预防商业性猪场中仔猪腹泻8。2.1.4 卵黄抗体在猪肠道内的变化规律对于新生仔猪，卵黄抗体能在肠道内能被有效吸收并被主动转运至循环系统，其吸收通道大约在出生后34h关闭。卵黄抗体在血清中的半衰期大约只有185天。抗体在0，3，6，21日龄的24h内都保持一定滴度，表现出卵黄抗体对胃酸和消化酶有良好的耐受性(Yokoyama,1992)。随着仔猪日龄的增加，其消化系统逐步发育完善，使得胃酸pH值降低和消化酶活性提高，卵黄抗体(IgY)分子在这种环境下结构易被破坏而失去活性。结合许多饲养试验结果，卵黄抗体在45周龄仔猪肠道内仍能保持相当高的稳定性。因此，对于34周龄的断奶仔猪，用卵黄抗体防治细菌感染能保证其有效性。2.2 卵黄抗体在猪防治其它疾病中的应用 刘湘新等(2004)9采用猪链球菌活疫苗(ST17I株)免疫鸡制作卵黄抗体，免疫效价达到1：1024，血凝抑制效价为1：1600，并且高免蛋可在730d维持。白静等(2006)10用猪瘟兔化弱毒苗免疫鸡制得抗猪瘟高免卵黄抗体(免疫效价为1:321:64)应用于临床并取得了良好效果。2.3 IgY在猪病诊断方面的应用卵黄抗体和哺乳动物免疫球蛋白有许多不同之处，如它不与金色葡萄球菌A蛋白结合，不与哺乳动物Fc受体结合，对哺乳动物补体无固定作用等，这使得卵黄抗体在检测诊断上具有更强的特异性和灵敏度，所以卵黄抗体可以应用于免疫荧光试验、ELISA试验、免疫扩散、免疫电泳等疾病检测手段上11。胶乳凝集试验是将可溶性抗原(或抗体)吸附于聚苯乙烯胶乳载体颗粒的间接凝集试验。根据此原理，将胶体金标记抗体固定于特制的载体，则为免疫金标记法。这种方法简便、快速、敏感、特异，广泛用于疾病的快速诊断。试验中常用的抗体是哺乳动物IgG。但聚苯乙烯胶乳吸附蛋白质存在结合不牢固的问题，影响了检测效果。由于IgY具有更高的特异性和敏感性，可用IgY代替IgG作胶乳凝集试验及制作胶体金。3 卵黄抗体制备技术研究3.1 影响鸡的免疫效果和抗体浓度的主要因素抗原剂量 能明显影响免疫效果和抗体浓度。不同抗原的最佳免疫用剂量应该通过具体实验获得。一般而言，小抗原可能需要用大剂量，或与载体(氨基酸)偶合；佐剂的使用 弗氏完全佐剂(FCA)仍是最有效的佐剂；抗原的施用途径 最常用肌肉注射(im)；免疫程序 免疫间隔过短会造成免疫效果的抑制，而长间隔的免疫效果更佳（前两次抗原注射的间隔至少4wk）12。3.2 IgY的提纯通过纯化提取卵黄抗体，可消除垂直传播疫病的危险性，同时可免除卵磷蛋白等大分子物质的副作用。提纯可以分为以下几类：(1)沉淀法：有氨基酸盐或硫酸钠法、聚乙烯醇(PEG)法、辛酸法、水溶解法、硫酸葡聚糖沉淀法 (2)色谱层析法：有亲和层析法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法。此外还有超声过滤法等。近来PEG法成为最常用和最高效的提取方法。Polson(1980)13首先提出聚乙二醇(PEG)两步沉淀法，分别用终浓度为3.5%和12%的PEG分步沉淀，用硫酸铵盐析法去除PEG。随后人们在此基础上提出了冷乙醇沉淀的改进方法，使产量提高，而且能有效地去除残留PEG。水稀释法也是常用的有效手段，Akita(1992)14等用该法提纯IgY，每个卵黄可获得100mg以上的IgY。此后，Akita等比较了水稀释法法、PEG法、硫酸葡聚糖沉淀法和黄原胶法(Xanthan法)的提纯效果，结果表明：WD法产量最高，其次为硫酸葡聚糖沉淀法，WD法更适合大规模生产。3.3 冷冻干燥或喷雾干燥冷冻干燥技术可将纯化的抗体在预先冷冻的状态下，不经液态直接升华除去水分而获得干粉型制剂，它避免了液态下保存的抗体易失活易变形的缺点，能够长时间保存。胡晓苗(2006)采用冷冻真空干燥机以浓度5%的蔗糖为冻干干燥剂将纯化的IgY制成冻干卵黄抗体，结果表明冻干前后效价不变，而且对温度耐受力显著增强。但是由于设备和化学试剂的因素导致生产成本较高。 喷雾干燥也是制取固态IgY的常用手段。它具有原料受热破坏程度较低、干燥速度快、便于工业化生产等特点。采用喷雾干燥技术干燥IgY时，应注意进风温度、出风温度和进料速率等因素，以保证IgY有较高的活性。李学伍等(2000)15将液体卵黄经140进气，72出气，瞬间干燥制成抗大肠杆菌卵黄抗体干粉。测定其卵抗体效价测定结果证明，除了黏附在管壁上的抗体滴度稍有下降外，正常喷出的干粉其抗体滴度保持不变。4问题与展望卵黄抗体有其自身优势，但IgY在生产中也存在不容忽视的问题：经蛋垂直传播疫病的病原，可能存在于卵黄抗体中如减蛋综合征、禽白血病、禽沙门氏菌病、鸡慢性呼吸道病等；蛋黄中含有大量分子量很大的卵黄磷蛋白及脂肪等物质，注入肌肉难以吸收而造成局部肿胀、坏死和过敏反应。卵黄抗体粉是高蛋白物质，营养丰富，生产过程中极易污染细菌；随着仔猪消化系统逐步发育完善，使得胃酸pH 降低和消化酶活性提高，IgY的分子结构易被破坏而部分失去活性，因此，需要进一步研制开发IgY的有效保护剂；生产卵黄抗体还没有规范的操作规程，也没有用于监测的质量标准。，应尽快建立、完善和统一IgY的产品质量标准，以保证其产品质量的可靠性。应用抗生素容易导致药物残留和耐药性；用疫苗免疫母猪，母源抗体含量高但持续时间短；口服高免动物血清成本较高。IgY作为一种新型的绿色添加剂，具有安全、经济、高效的特点，符合人们对于安全绿色食品生产的要求，因此在生物制品的开发和疾病的防治方面具有广阔的前景。多价卵黄抗体微生态制剂是多价卵黄抗体与益生菌两种活性物质有机组合的固体制剂，能充分发挥卵黄抗体的特异性免疫功能与益生菌的非特异性免疫及相应生理促进功能，达到预防和治疗感染性疾病的作用，而且具有无污染、无抗药性、无残留、药效持续时间长等特点，可有效替代抗生素，在畜牧保健领域有广阔的应用前景。参考文献：1. Warr GW, Magor KE,Higgins DA.IgY clues to the origins of modern antibodies.Immunology Today,1995,16(8):3923982. Patel S K., Doston J., Allen K P., et al. Identification and molecular characterization of EatA, an autotransporter protein of enterotoxigenic Eschercia coliJ.Infect Immun, 2004, 72(3):17861794.3. 缪德年,徐福南,方明生等.哺乳仔猪大肠杆菌性腹泻J.中国兽医科技,1996,26(7):4244.4. Jin L Z, Baidoo S K, Marquardt R R.et alIn vitro inhibition of adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88 to piglet intestinal mucus by egg-yolk antibodiesJ.Immunol Med Microbio1,1998,(22):31332l5. Yokoyama H.Peracta R C, Sendo S, et a1.Detection of passage and absorption of chicken egg yolk immunoglobulins in the gastroin-testinal tract of pigs by use of enzyme-1inked immunosorbent assay and fluorescent antibody testingJ. American Journal of Veterinary Research,1993,54(6)：8678726. 高云英,赵发苗,张金良等.鸡抗猪大肠杆菌高免卵黄抗体的研制与应用J.畜牧兽医杂志，2003,22(1):687. 肖弛,周淑兰,徐志等.鸡抗猪大肠杆菌卵黄抗体的研制与应用J.中国兽医科技,1998,28(40):21238. 李晓宇,徐荣平等.特异性卵黄抗体在防治仔猪大肠杆菌性腹泻中的应用J.中国饲料,2003,(21):35.9. 刘湘新,程天印等.抗猪链球菌病高免卵黄抗体的研制J.中兽医医药杂志,2004,(6):49