产品无菌热源检验规范.doc

.产品无菌、热原检验规范文件编号版 号页 次发 布 日 期1目的 应用适当的试验来评价产品的生物性能，以确保产品的生物检验方法的准确性。2范围 本方法适用于产品的无菌及热原的检查。3依据标准 GB8368ISO8536-4一次性使用输液器 GB8369ISO1135-4一次性使用输血器 GB15810ISO7886一次性使用无菌注射器 GB15811ISO7864一次性使用无菌注射针GB18671一次性使用静脉输液针GB/T14233.2医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法 YZB/国3970-2011一次性使用真空采血器配套用针YZB/国5005-2011一次性使用分装输液器带针YZB/赣2269-2013一次性使用配药注射器带针YZB/赣2270-2013一次性使用配药用针4 无菌试验4.1原理 灭菌不完全的产品均含有细菌或霉菌，将欲检查的产品经过严密的无菌操作方法接种到适宜的培养基内，然后放在适宜的温度下，为微生物准备一个最适宜的生长条件，放置一定时间，微生物就能大量繁殖，培养基也就由清变浊，利用此法来测知产品是否有菌。 4. 2主要设备超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。4. 3培养基制备4.3.1在配制培养基前，先配少量培养基观察其灭菌后是否有浑浊，长菌情况是否良好，合格后方可大量配制。在更换厂牌号时应重试。产品无菌、热原检验规范文件编号版 号页 次发 布 日 期4.3.2 若干种培养基的配制与使用a)硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌氧菌）：按瓶装上的说明书要求配制，溶解，搅拌均匀，灭菌，即得。在供试品按种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基1/5，否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20mim），迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。硫乙醇酸盐流体培养基置3035培养。b)改良马丁培养基（用于培养真菌）：按瓶装上的说明书要求配制，溶解，搅拌均匀，灭菌，即得。 改良马丁培养基置2328培养。C) 普通肉汤琼脂培养基（供细菌用平板或斜面）：按瓶装上的说明书要求配制，溶解，搅拌均匀，灭菌，即得。普通肉汤琼脂培养基置3035培养。4.4培养基的要求4.4.1在使用前，细菌培养基须经3035培养48h，真菌培养基经2328培养72h，证明无菌方可使用。4.4.2制备好的培养基应保存在225、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。管内厌氧区小于液面高度的三分之一不得使用。4.5试验前准备4.5.1器具灭菌与供试液接触的所有器具应采用可靠的方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121 30mim，或置电热干燥箱内160 2h。4.5.2无菌室要求无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。a) 无菌室内除定期用甲醛加高锰酸钾（或甲醛蒸汽）消毒外，每次操作前用75%洒精或消毒溶液擦试工作台面及一些可能污染的死角。用紫外灯杀菌至少30min。在每次操作完毕后，同样用上述液体擦试工作面。无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取内径90mm双碟，无菌操b) 作注入融化的大豆酪蛋白琼脂培养基20ml，制成平板，先在3035培养48h证明无菌后，取双碟平板3只，在无菌室操作台内平均放置，打开碟盖，暴露30mim后盖好，置3035培养48h后取出检查，3只双碟上生长的菌落数平均不得超过1个。c) 无菌试验过程中也需要检查无菌室的菌落数，方法同上。在试验开始进行时，打开碟盖，至试验结束盖好，照上法培养，应符合上述要求4.6对照菌液的制备 取金黄色葡萄球菌的普通琼脂斜面新鲜培养物，接种一白金耳至硫乙醇酸盐流体培养基内。在3035培养18h24h后，用无菌0.9%氯化钠注射液稀释成1:106即得。产品无菌、热原检验规范文件编号版 号页 次发 布 日 期4.7试验方法4.7.1供试液的制备按各产品标准中规定的制备方法制备供试液。名称无菌供试液的制备输液器类取若干套灭过菌的输液器，管内腔注入浸提介质10ml,（按管内表面积每10cm2流过管内腔1ml浸提介质），反复振洗数次，即得。注射器类取6支注射器样品，在无菌室内注射器抽取0.9%氯化钠注射液至总刻度容量，回拉芯杆，使活塞稍离液面5次，即得。注射针将10支注射针直接投放到无菌培养基中。配药用针同“注射针”。静脉输液针取若干套支输液针，管内腔注入浸提介质2ml,（按管内表面积每10cm2流过管内腔1ml浸提介质），反复振洗数次，即得。采血针同“输液针”。4.7.2按无菌操作法，每批供试液分别接种硫乙醇酸盐流体培养基5管。另取2管硫乙醇酸盐流体培养基，1管接种金黄色葡萄球菌菌液1ml，供作阳性对照；1管作为阴性对照。再取改良马丁培养基2管分别接种供试液。培养基的分装量为40ml，供试液的每管接种量为5ml。4.7.3接种后，上述接种后的培养基按规定的温度培养14天。4.8结果判定 当阳性对照管显浑浊并确定有细菌生长时(应在接种后24h有细菌生长)，可根据观察所得的结果判定。4.8.1如培养基均为澄清或显浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为被检产品合格。4.8.2 如培养基中任何一管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样依法复试两次。除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为被检产品不合格。4.8.3 如在加入供试液后，培养基出现浑浊或沉淀，经培养不能从外观上判断时，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或在斜面上有无菌生长；或取少量培养液，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。5热原试验5.1原理 本法采用鲎试剂法，即细菌内毒素法。利用试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。5.2试剂5.2.1细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。5.2.2细菌内毒素工作品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。5.2.3鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ ml，规格为0.1ml。产品无菌、热原检验规范文件编号版 号页 次发 布 日 期5.2.4检查用水：内毒素含量小于0.015 EU/ ml的灭菌注射用水。5.3主要设备超净工作台、恒温水浴锅、电热干燥箱、旋涡混合器。5.4试验前的准备5.4.1器具除热原 与检验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内180 干烤2h，或250干燥1h；塑料器具置30%双氧水中浸泡4h，再用检查用水冲洗后于60烘干备用。5.4.2检验液的制备 按各产品标准中规定的方法制备检验液。名称热原供试液的制备输液器类取三套灭过菌的输液器，管内腔注入浸提介质10ml,反复振洗数次，两端封闭，封闭在372恒温箱中，保持2h,取出后将输液器内的试液汇聚在无热原的玻璃器皿中，供试液贮存不得超过2h。注射器类取至少3支注射器，抽取无热原水或0.9%的氯化钠注射液至总刻度容量，将芯杆拉回到外套开口处，液体来回振洗两次，封闭在372恒温箱中，保持2h,取出后将注射器内的试液汇聚在无热原的玻璃器皿中，供试液贮存不得超过2h。注射针将25支注射针浸入250ml无菌，无热原的0.9%氯化钠溶液中，在37+30温度下恒温1h,取出注射针获得供试液，供试液的贮存不得超过2h.配药用针同“注射针”。静脉输液针取注射器抽取抽取5ml浸提介质与输液针连接，注入输液针内腔至充满后，密封针头端，一起置37恒温箱中浸提1h,将注射器中的剩余浸提介质推注流过输液针内腔，收集全部浸提液进行试验，细菌内毒素限量应小于0.5EU/ml。采血针同“输液针”。5.5试验步骤5.5.1将细菌内毒素工作标准品用检查用水逐次稀释至0.5EU/ml，供作阳性对照。5.5.2将细菌内毒素工作标准品用样品检验液逐次稀释至0.5EU/ml，供作样品阳性对照。5.5.2取8支规格为0.1ml的鲎试剂，分别按标量加入检查用水溶解。然后指定两管供试管，各加入0.1ml供试液；两管阴性管，各加入0.1ml检查用水；两管阳性对照管各加入0.1ml细菌内毒素工作品稀释液（0.5EU/ml）；两管样品阳性对照管各加入0.1ml细菌内毒素工作品稀释液（0.5EU/ml）与检验液的混合液。5.5.3轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入371水浴中保温60 min2min，轻轻取出，观察结果。产品无菌、热原检验规范文件编号版 号页 次发 布 日 期5.6结果判定5.6.1 将鲎试剂缓慢倒转180，管内容物呈坚实凝胶者为阳性记录为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。5.6.2 供试品2管均为(-)性时，判定产品符合本法规定,不再进行热原试验。5.6.3 供试品2管均为(+)或有1管为