动物源性ω-3 PUFAs对耐多柔比星人卵巢癌细胞系A2780逆转耐药性研究.doc

动物源性-3 PUFAs对耐多柔比星人卵巢癌细胞系A2780逆转耐药性研究作者：黄雯雯单位：汕头大学医学院第一附属医院药剂科， 广东 汕头 515041【摘要】目的：通过人卵巢癌细胞及多柔比星耐药株的体外细胞毒性实验，探讨两种动物源性ω-3多不饱和脂肪酸对耐多柔比星人卵巢癌细胞系A2780 逆转耐药性的作用。方法：采用浓度梯度倍增法诱导建立耐药细胞A2780/DXR，并与亲代细胞A2780进行耐药性比较。将耐药细胞A2780/DXR和亲代细胞A2780分别分为空白对照组、VRP逆转对照组（VRP10μmol/ml）、DHA10μmol/ml组、DHA20μmol/ml组、EPA10μmol/ml组、EPA20μmol/ml组，用动物源性ω-3多不饱和脂肪酸对A2780/DXR进行逆转耐药。结果：亲代细胞A2780组，DHA20μmol/ml和EPA20μmol/ml的逆转效果与VRP10μmol/ml的逆转效果具有显著性差异（P0.05）；耐药细胞A2780/DXR组，DHA20μmol/ml的逆转效果与VRP10μmol/ml的逆转效果具有显著性差异（P0.05）。结论：动物源性ω-3多不饱和脂肪酸DHA、EPA均能有效逆转耐药株对DXR的敏感性，且有明显的剂量依赖性。其中尤以EPA（20μmol/ml）的逆转作用更加明显。 【关键词】 ω-3多不饱和脂肪酸； 多柔比星； 人卵巢癌细胞； 逆转耐药性 Study the Drug Resistance Reversion of Animal Origin ω-3 Polyunsaturated Fatty Acids to Human Ovarian Carcinoma Cell Line A2780 Holding Doxorubicin(DXR) Resistance HUANG Wen-wen (The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Guangdong Shantou 515041, China) Abstract： Objective： To approach the drug resistance reversion effect of two kinds of animal origin ω-3 polyunsaturated fatty acids, to human ovarian carcinoma cell line A2780 holding doxorubicin(DXR) resistance, by the vitro cytotoxicity experiment of human ovarian cancer cell and doxorubicin persister. Methods:To induce and set the drug resistance cell A2780/DXR by concentration gradient multiplication method, and do drug resistance comparison with parent cell A2780. The drug resistance cell A2780/DXR and parent cell A2780 were divided respectively into blank control group, VRP reverse control group(VRP 10μmol/ml), DHA 10μmol/ml group, DHA 20μmol/ml group, EPA 10μmol/ml group, EPA 20μmol/ml group. To reverse the drug resistance of A2780/DXR by animal origin ω-3 polyunsaturated fatty acids. Results: In parent cell A2780 group, the reverse effect of DHA 20μmol/ml and EPA 20μmol/ml had significant difference (P0.05), compared with VRP 10μmol/ml. In the drug resistance cell A2780/DXR group, the reverse effect of DHA 20μmol/ml had significant difference (P0.05), compared with VRP 10μmol/ml. Conclusion: Animal origin ω-3 polyunsaturated fatty acids DHA and EPA both reverse effectively the sensitivity of persister to DXR. Both have conspicuous dose dependent. Especially, the reverse effect of EPA 20μmol/ml is more conspicuous.Key words: ω-3 polyunsaturated fatty acids; Doxorubicin(DXR); Human ovarian cancer cell; The drug resistance reversion 肿瘤治疗过程中，耐药是导致化疗失败的重要原因之一。维拉帕米等逆转剂虽在临床上能较为有效地逆转耐药细胞对化疗药物的敏感性，但其使用禁忌及不良反应使其在实际应用中受到限制。寻找出一类安全、毒副作用小及效果显著的逆转药物成为医药工作者的研究热点。本研究从“药食同源”的观点出发，探讨动物性食物来源的ω-3多不饱和脂肪酸对耐药肿瘤细胞的逆转作用。 1 材 料 1.1 主要药物和试剂:RPM1640培养基（购自Invitrogen公司）；DMEM、10胎牛血清（FBS）、DHA、EPA（购自Sigma公司）；MTT、SDS（购自上海华舜生物工程有限公司）；多柔比星（DXR ，深圳万乐药业有限公司，批号：041105）；维拉帕米（VRP，上海禾丰制药有限公司，批号：050102）。 1.2 人卵巢癌细胞株:人卵巢癌细胞株A2780，购自中国科学院上海生化细胞所。 2 方 法 2.1 卵巢癌细胞多柔比星耐药株的制备1:采用浓度梯度倍增法诱导建立耐药细胞A2780/DXR。首先分别向生长有A2780细胞株并处于对数生长期的培养瓶内加入不同浓度的DXR，培养1周后观察细胞死亡情况。选择可将80%的细胞杀死的药物浓度(ID80)作为耐药细胞培养的起始浓度；然后将肿瘤细胞置于含有ID80药物的培养液中培养，24h后更换不含药物的1640培养液继续培养。待细胞稳定生长、进入对数生长期后，传代两次，再将细胞株于加倍剂量(2×ID80)的DXR中继续培养；依此类推，共经过9个浓度梯度、约10个月的培养。取脱药培养3代并处于对数生长期的细胞用于下一步研究。 2.2 A2780/DXR与A2780耐药性比较:采用MTT法将上述耐药细胞及亲代细胞置于96孔板中，每孔2×103，加入含有不同浓度的DXR(0.0150μmol/L) RPMI1640完全培养基，每样本设3个复孔。3d后加入20μl的MTT(5mg/ml)孵育4h，加入10% SDS150μl溶解产生的沉淀，酶标仪上570nm计算OD值（每组平行操作重复3次），以成活率为95的AMD浓度作为下一步实验的最低作用浓度，自成活率为95起记录两株细胞不同浓度DXR的成活率。 2.3 动物源性ω-3多不饱和脂肪酸对A2780/DXR逆转耐药实验 2.3.1 实验分为耐药株组（A2780/DXR）和亲代细胞组（A2780）两大组，每组再细分为空白对照组、VRP逆转对照组（VRP10μmol/ml）、DHA10μmol/ml组、DHA20μmol/ml组、EPA10μmol/ml组、EPA20μmol/ml组。 2.3.2 根据2.2实验结果，两个细胞株采用成活率为95的DXR为逆转耐药实验的最低作用浓度。按分组每孔分别加入含相应浓度的DXR，置于5CO2，37培养48h；取出每孔加入50μlMTT，再置于5CO2，37培养4h。加入10% SDS150μl溶解产生的沉淀，在酶标仪上570nm计算OD值（每组平行操作重复5次）。每组DXR浓度与细胞成活率线型回归，并计算细胞株的IC50值，空白对照组、阳性对照组与各实验组数据采用t检验。 3 结 果 A2780/DXR与A2780耐药性比较表1 不同浓度DXR对卵巢癌细胞成活率的影响 从表1可知，A2780/DXR对AMD的耐药性为亲代细胞（A2780）的50倍，表示耐药株制备成功。卵巢癌细胞株加入DHA、EPA后IC50的变化。表2 卵巢癌细胞株加入不同浓度DHA、EPA后IC50的变化 讨 论 4.1 维拉帕米是临床上常用的MDR逆转剂。从结果显示，作为阳性对照组，其对耐药株的逆转率为6.1，而对敏感株的逆转率仅为1.1，能很好地逆转耐药株对DXR的敏感性。但是，维拉帕米本身也是一种抗心律失常的药物，应用于肿瘤治疗时对于严重左心室功能不全、 低血压（收缩压小于90mmHg）或心源性休克、病窦综合征（已安装并行使功能的心脏起搏器病人除外）、 II或III度房室阻滞（已安装并行使功能的心脏起搏器病人除外）、心房扑动或心房颤动病人合并房室旁路通道以及已知对盐酸维拉帕米过敏的病人是严禁使用的2。而且作为化学药物，其自身引起的副作用不适于临床应用。 4.2 多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是指结构中含有两个或两个以上双键的长链脂肪酸，根据碳链羧基端起最后一个双键相对于甲基碳(ω碳)原子的位置，将其分为ω-3族、ω-6族、ω-7族和ω-9族PUFAs，其中ω-3和ω-6族在机体各种生理功能调节中发挥重要作用。豆油的代表物质有亚油酸 (18:2ω-6，LA)、γ-亚麻酸(18:3ω-6，GLA)和花生四烯酸(20:4ω-6，AA)；ω-3PUFAs主要包括α-亚麻酸 (18:3ω-3，ALA)、二十碳五烯酸(20:5ω-3，EPA)和二十二碳六烯酸(22:6ω-3，DHA)，其中ALA主要来源于芸苔属植物油(canolaoil)和豆油，EPA和DHA在多脂的深海冷水鱼类(如鲑鱼、鲭鱼、蹲鱼、金枪鱼)和海藻中含量丰富，对人类来说为食源性物质。 4.3 从实验结果显示，DHA和EPA作为DXR逆转剂与AMD同时作用于卵巢癌细胞时，对耐药株表现出明显的逆转现象，尤其是以20μmol/ml 用量的EPA，其逆转倍数尤为显著且大于维拉帕米（IR=6.1）。而且，DHA与EPA对DXR耐药株的逆转为剂量依赖型。 4.4 一般认为，ω-3PUFAs所含不饱和双键越多越易氧化，对肿瘤生长和转移的抑制作用越强，且呈剂量依赖性关系3，这与本实验数据相吻合。有研究显示3联合应用前氧化剂枸橼酸铁能进一步提高杀瘤作用，而应用抗氧化剂VitE或自由基清除剂SOD则会削弱甚至阻断这一作用，这提示ω-3PUFAs对肿瘤细胞的直接杀伤效应可能归因于脂质过氧化反应和自由基的产生。 另一方面，外源性ω-3PUFAs易结合到瘤细胞膜上，通过酶途径（细胞来源的过氧化物酶如Cox）和非酶途径（膜脂的自由基打击）产生脂质过氧化产物和活性基团，这些物质能机械性损伤肿瘤细胞膜，导致膜穿孔，引起细胞内蛋白质、氨基酸交联及DNA、RNA共价结合，破坏线粒体脂膜，造成瘤细胞多方面的损伤，最终导致细胞死亡。 自由基还能作用于膜磷脂的其他脂肪酸引起脂质过氧化连锁反应，形成更多的脂质过氧化产物，增强细胞毒作用4，5。由于肿瘤细胞内抗氧化酶含量低及相应的细胞抗氧化屏障缺陷，抵抗脂质过氧化反应的能力降低，随着脂质过氧化物和自由基积聚，容易遭受过氧化损伤4。 4.5 然而，ω-3PUFAs能有效逆转DXR的确切原因仍未完全证实，仍需开展进一步的研究。而ω-3PUFAs对其他类型的癌细胞株、对不同耐药性的细胞株以及在生物体体内能否有类似的逆转效果，将是我们下一步的研究方向。但可以肯定的是，ω-3PUFAs作为一种来源于食物的逆转剂，其安全性远高于临