小鼠耳蜗胚胎发育过程中Smad4基因的表达.doc

小鼠耳蜗胚胎发育过程中Smad4基因的表达【摘要】目的探讨小鼠内耳胚胎发育演变过程， 检测Smad4基因在小鼠耳蜗中的表达情况。方法选用耳廓反应灵敏、健康的C57BL/6小鼠作为种鼠交配，用观察阴栓方法获得适龄胎鼠， 17天取胚胎头，18天在显微镜下取耳蜗，胚胎头水平冰冻切片， 耳蜗平行于蜗轴冰冻切片， HE染色方法观察小鼠耳蜗发育形态演变过程， 免疫组织化学方法检测Smad4蛋白在小鼠胚胎10 20天耳蜗中的表达情况。 结果胚胎10天，听泡发育，胚胎12天听泡下部有蜗管始基形成并开始发育。胚胎18天，蜗管发育2圈， 形成了可以辨认的内、外毛细胞，血管纹开始分化。 Smad4从胚胎15天才开始表达， 最初表达部位为耳蜗底转将发育成蜗轴以及柱状上皮分化为感觉细胞及支持细胞的区域， 但在胚胎早期表达较弱， 后期在耳蜗内广泛表达， 在螺旋器、血管纹、前庭膜均有表达， 且表达逐渐增强， 而在蜗轴部位的表达逐渐减弱。结论Smad4在小鼠内耳分化期有阳性表达， 且表达具有明显的阶段性和区域性， 说明其参与内耳听觉器官的发育过程并且可能在耳蜗的形成过程中起着重要的作用。 【关键词】 内耳；发育；耳蜗；小鼠；Smad4 Expression of Smad4 in the embryonic development of the mouse inner ear YU Ya-ping， YANG Shi-ming， HU Yin-yan， GUO Wei， SUN Jian-he YU Ning， HAN Dong-yi， YANG Wei-yan Department of Otolaryngology and Head Neck Surgery, Institute of Otolaryngology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853， China Corresponding author: Yang Shi-ming, Email: 【Abstract】 ObjectiveTo explore the developmental process of the embryonic mouse inner ear and to investigate whether Smad4 is expressed in the embryonic mouse cochlea. MethodsThe inner ears were obtained from C57BL/6 mice at ages ranging from gestational day 10 through day 20. Gestational age was determined by the vaginal plug technique （E1= day of the vaginal plug）. Frozen sections 6μm in thickness for embryos were processed for HE staining to observe morphological changes of the embryonic mouse cochlea and for immunohistochemistry to determine the expression of Smad4. ResultsAt the tenth day gestation otocyst was a closed ovoid sac. The cochlear duct started to develop at the twelfth day of gestation as an extension of the ventral part of the otocyst. At the eighteenth day the inner hair cells and outer hair cells were identified. The Smad4 gene was expressed in cochlea from E15. At first, it was expressed in the parts which should develop into the cochlear axes, sensory cells and supporting cells. Then smad4 expression was concentrated in supporting cells, hair cells, spiral ganglions and epithelia of the stria vascularis during a later stage. ConclusionThe Smad4 proteins exist in the embryonic mouse cochlea and it may be involved in the cochlear formation. Smad4 might be an essential factor for the development of the mouse cochlea. 【Key word】Inner ear;Development;Cochlea;Mouse;Smad4 哺乳动物内耳是一个非常复杂的器官， 耳蜗主要包含形成听觉必须具有的感受器，前庭感觉器官包括椭圆囊斑、 球囊斑和壶腹嵴，感受重力、直线和角加速度。内耳的一个显著特征是支配它感觉器官的神经节和它精密的三维结构均起源于一个简单的上皮组织空泡——听囊。听基板至听泡再发育成成熟内耳的过程是一极其复杂的过程，它包括外胚层上皮的引导，听囊的初步形成和改建，感觉上皮、非感觉上皮及神经元细胞的分化等过程，最终形成精细的迷路1-3。其间多种基因在时间和空间上精细地表达而且准确地控制调节着听觉发育过程，这些基因通过编码转录因子、生长因子、分泌因子或受体蛋白等重要的生物分子，以不同的机制对内耳发育起重要作用。 Smads基因是参与转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号下游的细胞质内信号转导分子，它主要介导BMP的信号。近来研究发现，TGF-β超家族中的骨形态形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）在脊椎动物的内耳形成中起着至关重要的作用4-5。故推测作为TGF-β传导通路上的信号分子Smad4可能在内耳的功能、发育方面也发挥重要作用。但是Smad4基因在小鼠胚胎耳蜗中是否有表达，在什么部位表达，什么时间表达以及其具体作用如何目前未见报道。本研究用免疫组化法检测了Smad4基因在C57小鼠耳蜗胚胎发育过程中的表达情况及表达部位，研究Smad4基因在内耳听觉发育中的作用。 1材料和方法 1.1实验动物 挑选耳廓反应灵敏、健康的2月龄C57BL/6小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）以公：母= 1：2的比例共40只作为种鼠，下午5点左右合笼，次日晨8点观察母鼠阴道，若有阴栓，记为胚胎第一天（E1）。 1.2标本处理 按规定日期，断头剖腹取孕第9天到第20天胚胎（其中 ≤ 17天取胚胎头， ≥18天在显微镜下快速取耳蜗）。标本浸泡固定于 4% 多聚甲醛 + 2.5%戊二醛中4 24h以上。10 EDTA脱钙48小时后放入20 的蔗糖溶液中过夜。OCT包埋作冰冻切片，胎头平行切片，耳蜗平行于蜗轴连续切片，片厚6 μm。连续切片，行常规HE染色，光镜下观察内耳形态学演变过程。间断取片-70 冰箱保存用于免疫组化。 1. 3Smad4基因表达检测 1.3.1一抗兔来源Smad4抗体，美国Santa Cruz生物技术公司生产， 稀释度为1：100。 1.3.2兔SP检测试剂盒，内配生物素化山羊抗兔抗体 （2抗）， 辣根酶标记链霉卵白素，正常封闭羊血清。 1抗、 兔SP检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。 1.3.3染色方法及步骤取冰冻切片， 60 烤片半小时。参照试剂盒说明进行免疫组织化学染色，DAB显色， 复染， 脱水， 透明， 封片。 其中Smad4抗体稀释度为1： 100， 阴性对照用PBS代替一抗。光学显微镜下观察结果。 2结果 2.1小鼠内耳耳蜗发育过程 小鼠胚胎头部切片方向如图1所示。E10 E11听泡呈椭圆形（图2a）。胚胎第12天听泡继续发育，听泡下部有蜗管始基形成并开始发育（图2b）。E14蜗管发育1圈（图2c）。胚胎第15天，耳蜗底周的柱状上皮分化为感觉细胞及支持细胞，底周的间充质变得疏松， 蜗管发育了1.5圈（图2d）。胚胎第18天，耳蜗底转未来形成Corti隧道的部位变得较明显，感觉上皮开始分化为三排外毛细胞和一排内毛细胞，血管纹开始分化（图2e、f）。 2.2Smad4在小鼠内耳发育过程中的表达 E14天之前未见Smad4表达（图3a），从胚胎15天开始表达，但在胚胎期表达较弱，在螺旋神经节、血管纹、毛细胞、支持细胞和盖膜中有表达。最初表达在耳蜗底转将发育成蜗轴及柱状上皮分化为感觉细胞及支持细胞部分(图3b、 c、 d、 e)，后来表达范围逐渐增大， 在螺旋器、 血管纹、前庭膜均有表达， 但在蜗轴表达减弱。 3讨论 小鼠具有相对较短的胚胎期，出生后快速的生长发育期，因此是研究哺乳动物内耳形态发生及细胞分化发育的极佳动物。近交系小鼠基因型高度纯合一致，品系内个体差异小，个体具备品系的全能性，因而在组织型型、形态学等任何可遗传的体征方面都完全一致，使实验结果有很好的一致性和可比性，国外研究内耳实验多采用近交系小鼠，国内传统上采用繁殖力较强的昆明白远交系小鼠，近几年也越来越倾向于采用近交系小鼠。因此在本实验中，我们采用近交系C57BL/6小鼠为实验动物。 小鼠胚胎早期内耳较小（听泡期整个胚胎0.5 cm），标本处理及解剖定位极其困难。在处理早期胚胎标本时，我们利用整个胚胎进行内耳解剖定位并作为观察对象，可以保证内耳结构的完整性，同时也可了解其和毗邻组织结构的解剖关系。整个胚胎头切片定位很难平行于蜗轴，最初我们尝试以不同的角度切片，没有得到很好的结果。我们仔细研究C57小鼠头制成颅骨的模型，打开听泡观察，发现以水平切片最为接近平行于蜗轴，故胚胎小于18天难以取内耳结构，我们采用整个胚胎头以水平位切片。每个时间段我们都采用连续切片观察结构。 Smad4是Smad蛋白家族中的成员，主要介导骨形态形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）的信号。它编码的SMAD4蛋白属于通用型SMAD，该基因的缺失将造成TGF-β信号转导障碍而导致生物体严重的功能缺陷。TGF-β信号分子参与包括细胞增长、分化、凋亡、致癌作用等多种生物进程6-7。有文献报道TGF-β1可通过听泡上皮和耳周间充质之间的相互作用从而对内耳的形成发生影响8，另外还有研究发现敲除TGF-β2可造成包括内耳在内的多种畸形表现9，故推测作为TGF-β传导通路上的信号分子SMAD缺失对内耳的发育、功能、细胞凋亡等方面也可能有影响。单倍体Smad4敲除后小鼠内耳听力明显障碍，也表明Smad4对内耳听觉有重要作用10。与本研究相似，赵玉林等11发现TGF-β1在小鼠胚胎发育的第15天 19天,在耳蜗的感觉上皮、支持细胞、血管纹、前庭膜、螺旋神经节神经元及前庭感觉器官椭圆囊斑及球囊斑的上皮有阳性表达。小鼠胚胎内耳上皮在发生分裂增殖后即进入分化期。胚胎第15天，耳蜗底周上皮及前庭感觉器官的上皮己开始大量分化为感觉上皮及支持细胞，同时血管纹及前庭膜也相继发生分化， 。而本研究中Smad4的阳性表达时相也正是在小鼠内耳上皮发生分化的时期，与TGF-β1表达时间吻合，说明在此过程中Smad4可能主要对内耳上皮的发育起促进分化作用，且Smad4与TGF-β1有关。 本实验Smad4从胚胎15天开始表达，但在胚胎期表达较弱，最初表达在发育成蜗轴及耳蜗底转柱状上皮分化为感觉细胞及支持细胞的部分，但蜗轴形成后在蜗轴部分的表达减弱。说明Smad4参与骨形成，可能与TGF-β超家族的另一成员骨形成蛋白（BMP）有一定的相关性。Smads家族的信号传导是一个及其复杂的网络，对于它们的确切机制尚未清楚。Smad4在内耳的确切作用，如何调控内耳发生等都需要进一步的研究。本研究是用免疫组化法检测了Smad4在耳蜗发育过程中的表达情况及表达部位，为近一步研究Smad4在内耳中的作用打下基础。【参考文献】 1Kikuchi K, Hilding D. The development of the organ of Corti in the mouse. Acta Otolaryngol, 1965, 60 (3): 207-222.2Sher A. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta Otolaryngol Suppl，1971, 285: 1-77.3Lim DJ, Anniko M. Developmental morphology of the mouse inner ear. A scanning electron microscopic observation. Acta Otolaryngol Suppl，1985, 422: 1-694Chang W, Nunes FD, De Jesus-Escobar JM, et al. Ectopic noggin blocks sensory and nonsensory organ morphogenesis in the chicken inner ear. Dev Biol，1999, 216(1): 369-381. 5Takemura T, Sakagami M, Takebayashi K, et al. Localization of bone morphogenetic protein-4 messenger RNA in developing mouse cochlea. Hear Res，1996, 95(1-2): 26-32.6Massague J. TGF-beta signal transduction. Annu Rev Biochem，1998, 67: 753-791.7Massague J, Blain SW, Lo RS. TGFbeta signaling in growth contro