丙泊酚对心肌细胞.doc

丙泊酚对心肌细胞 Bcl-2 、Bax蛋白表达的影响 黑龙江省医院麻醉科吴双全摘要：本文主要阐述丙泊酚对Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响，从而从另外一个角度说明丙泊酚对心肌的保护作用资料与方法：培养的心肌细胞随机分为5组，每组10个样本，既正常对照组，阿霉素（ADR）损伤组，25 mol/L丙泊酚（PR）ADR组，50 mol/L PRADR组，100 mol/L PRADR组通过电镜观察以及免疫组化方法检测Bcl-2、Bax蛋白表达变化结果：ADR损伤组Bcl-2蛋白表达水平高于对照组（P 0.05）；PR（50 molL1）组心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平高于ADR损伤组（P 0.01）与损伤组比较，Bax 组细胞胞浆内棕黄色颗粒减少，并且染色较浅（图6，C）。ADR损伤组Bax蛋白表达水平高于对照组（P 0.01）；PR（50 molL1）组心肌细胞Bax蛋白表达水平低于ADR损伤组（P 0.05）结论：从Bcl-2、Bax 蛋白表达的变化可以看到丙泊酚的心肌保护作用关键词：丙泊酚，Bcl-2、Bax 蛋白，心肌保护作用丙泊酚对心肌的保护作用已经有很多的报道。但是对Bcl-2、Bax 蛋白 蛋白表达的影响还没有报道。本文将从细胞学的角度来观察丙泊酚对心肌的保护作用。资料及方法：(一) 原代培养的心肌细胞的准备将出生1-3天的Wistar乳鼠浸泡70%的酒精中消毒，开胸后取心室肌，用Hanks液清洗2次，剪碎，放入10ml离心管中；离心管中装有5倍体积的0.25%胰酶，37消化10分钟后，加等体积的RPMI-1640全培养液终止消化，自然沉淀；取出沉淀物，放入另一盛有胰酶的离心管中，重复上述消化过程4次，每次3720分钟；收集除第一次以外的上清液，1500rpm离心15分钟，弃上清，用含10胎牛血清的高糖 DMEM培养液充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，经 200 目筛网过滤去除未消化组织块。然后按差速贴壁分离法 37、5%CO2 孵育 1-1.5 小时，纯化心肌细胞。细胞计数，相同密度接种于培养瓶中，37，5%CO2条件下培养。于培养后12 h 即可见部分细胞收缩,24 h 后换液,此时心肌细胞约9 0 %以上都在收缩, 速率达96/ min120/ min 。以后每3 d 换1 次液,取第4 天的细胞进行实验研究。(二) 实验分组培养的心肌细胞随机分为5组，每组10个样本，具体为：1、正常对照组：正常细胞培养，不做任何处理；2、阿霉素（ADR）损伤组：在培养液中加入ADR，使其终浓度为1 ng/ml；3、25 mol/L丙泊酚（PR）ADR组：在培养液中加入 PR,使其终浓度为25 mol/L，37 培养2 h,再加入ADR 1 ng/ml ，继续培养12 h；4、50 mol/L PRADR组：在培养液中加入 PR,使其终浓度分别为50 mol/L,以下方法同（3）；5、100 mol/L PRADR组：在培养液中加入 PR，使其终浓度分别100 mol/L，以下方法同（3）。（三）电镜观察培养心肌细胞超微结构改变25cm2培养瓶培养3d的细胞，在药物作用结束后，用PBS轻轻洗涤细胞23次，收集细胞，用2.5%戊二醛固定24h，脱水，包埋，超薄切片，透射电镜下观察心肌细胞超微结构。（四）免疫组化方法检测Bcl-2、Bax蛋白表达变化细胞在经4%多聚赖氨酸预处理的盖玻片上（盖玻片放置于24孔培养板内）培养，终止培养后取出24孔板内的玻片进行如下操作：用PBS冲洗三次，多聚甲醛固定30min；PBS冲洗，Triton作用15min；PBS冲洗，3%H2O2作用10min；4、PBS冲洗，抗原热修复：将玻片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的耐热容器中，置于微波炉内加热至9498后，在保温20min，取出容器，放在室内，使之自然冷却至室温；5、倾去血清，滴加Bcl-2、Bax一抗（兔抗大鼠），湿盒中过夜；6、PBS冲洗，滴加二抗（山羊抗兔），37孵育20min；7、PBS冲洗，二氨基联苯胺(DAB)染色；8、苏木素复染1min，蒸馏水冲洗蓝化。在高倍镜下随机计数10个视野，细胞核内含棕色颗粒为阳性细胞，计算阳性百分率。四、统计学处理计量资料数据以均数标准差(S)表示,组间比较采用t检验。阳性率的比较采用x检验。P 0.05表示差异显著。结果：正常组心肌细胞胞浆内未见棕黄色颗粒状物质表达,心肌细胞形态较完整(图A)；ADR损伤组心肌细胞 Bcl-2 蛋白免疫细胞化学检测结果显示: Bcl-2 组心肌细胞胞浆内可见少量棕黄色颗粒状物质表达,染色较浅（图B）；丙泊酚保护组 Bcl-2 蛋白免疫细胞化学检测结果显示: 与损伤组比较 Bcl-2 组细胞胞浆内棕黄色颗粒增多，并且染色较深，呈弥漫性分布（图C）。ADR损伤组Bcl-2蛋白表达水平高于对照组（P 0.05）；PR（50 molL1）组心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平高于ADR损伤组（P 0.01）。 A BC图培养的新生大鼠心肌细胞 Bcl-2 蛋白的表达（400）FigA. Control group； B. ADR group； C. PR（50 molL1）group表 各组心肌细胞 Bcl-2 蛋白表达阳性率的比较Tab Comparison of the positive Bcl-2 expression rate of cardiomyocytes in different groupsGroup细胞数阳性细胞数阳性率（%）Control456357.7ADR4205412.9PR（50molL1）3968822.2P 0.05 vs Control group; P 0.01 vs ADR group图 各组心肌细胞 Bcl-2 表达阳性率的比较Fig Comparison of the positive Bcl-2 expression rate of cardiomyocytes in different groups(P 0.05 vs Control group; P 0.01 vs ADR group)讨论：丙泊酚是广谱的麻醉药，在临床上发挥重要的作用。近年来，丙泊酚在心血管方面的研究日益广泛，特别是在缺血/再灌注损伤和心肌细胞凋亡方面已经成为研究的热点。本实验以原代培养的新生大鼠心肌细胞为研究对象，观察不同浓度浓度丙泊酚对阿霉素所致心肌细胞损伤的保护作用，并初步探讨其机制。本研究从细胞水平上，进一步阐明丙泊酚在心血管系统的生理和病理作用，以便为心血管疾病的防治提供一个新思路。目前研究已知，Bcl-2家族至少有15个成员，按其功能，可分为促进凋亡或抑制凋亡两大类。 抑制凋亡的Bcl-2亚族包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等。它们主要存在于线粒体外层膜上，可直接或间接地阻止CytC自线粒体释出，抑制细胞凋亡。Bcl-2（B cell lymphoma/leukemia-2）基因是1984年由Tsajimato等从滤泡性淋巴细胞瘤中分离出来的一种癌基因，与细胞存活能力有关，主要分布于线粒体外膜和核膜, Bcl-2羧基末端作为信号锚插入线粒体外膜，其胞浆多肽部分对蛋白酶敏感。Bcl-2具有恢复和调制PTP功能的作用，因而可阻止凋亡启动因子从线粒体向外释放。 促进凋亡的Bax亚族包括Bax、Bak、Bad等。Bax是重要的异二聚体伴分子， Bax存在于细胞浆内，受凋亡信号诱导后，其结构发生改变，并转移至线粒体膜与Bcl-2共存，在膜上形成通道，引起CtyC释放，诱导细胞凋亡49-50。Bcl-2必须结合Bax才能发挥其作用，Bcl-2与Bax蛋白量的比率决定异二聚体（Bcl-2/Bax）与同二聚体(Bax/Bax)的比值，从而决定细胞凋亡的易感性。Bad以浓度依赖性方式替代Bcl-2/Bax 、BclXL/Bax异二聚体中的Bax，使Bax游离而促进细胞凋亡，Bad通过调节Bax同二聚体与异二聚体量的比值而介导凋亡，当细胞内异二聚体的含量50%时，则细胞耐凋亡；而当细胞内Bax同二聚体80时则细胞出现凋亡。Bcl-2抑制凋亡机制可能是：直接抗氧化；抑制线粒体释放凋亡蛋白质，如CytC,AIF；抑制促凋亡蛋白Bax、Bak的细胞毒性；抑制凋亡蛋白caspase的激活；高浓度可抑制正在发生凋亡的细胞内质网中Ca2+释放，维持细胞钙稳态；直接或间接与细胞信号转导蛋白如P53结合而调控凋亡。本研究显示，（1）阿霉素组心肌细胞凋亡指数明显高于对照组，说明细胞凋亡参与了阿霉素心肌病的病理过程，并且也证明阿霉素损伤模型复制成功；（2）与正常对照组相比