不同盐度条件下湿生植物大米草的生长及生理生化指标变化的研究 - 欢迎.doc

不同盐度条件下湿生植物大米草的生长及生理生化指标变化的研究章竞子 ,陈城，吴明，田寅辉，常福辰(南京师范大学生命科学学院,江苏南京210097)摘要：研究了大米草在低NaCl盐度（0-26.726%）的条件培养下，其根系活力，可溶性蛋白含量，谷胱甘肽（GSH）含量，超氧化物岐化酶（SOD）活性，丙二醛（MDA）含量及过氧化氢酶（CAT）活性的变化。研究结果表明，SOD、CAT活性和GSH含量以及可溶性蛋白含量在NaCl为10g/ L浓度下均具有一个峰，与正常海水（NaCl浓度为26.726g/L）培养条件下所得结果相近；而在NaCl为0g/ L浓度下，除丙二醛（MDA）含量达到最高值外，其余各项指标均较低。因此，大米草的最适盐度在1%左右，盐度为0g/ L时最不适合大米草的生长。关键词：大米草，盐度胁迫，生理生化指标0 引言大米草属多年生植物大米草（Spartina anglica）于1963年由南京大学钟崇信教授从英国引入我国1，2， 19791980年最先在福建、江苏海滨试种，初衷是抵御风浪、保滩护岸，成效明显，同时用于生产饲料和用作造纸原料。在引种后的20年中大米草得到推广发展，从辽宁锦西向南沿中国海岸到达广西海滩，到1985年至少栽培有3万公顷以上，使大米草的分布范围从温带向南扩大到了北纬21273。大米草作为先锋植物在滩涂定居并扩展后，可使土壤盐度降低，更适合其他耐盐性略低于先锋植物的其他植物生长。证明大米草具有明显的生态效应与经济效应。大米草的引进使滩涂被有效利用，并为周围居民带来一定经济收益。然而，因大米草密集生长、抗逆性与繁殖力极强，且大米草属植物为外来物种，在引种地食物链中缺乏对应的天敌等限制因素，据报道，在90年代后，大米草已遍布沿海80多个县，在非引种区域滩涂蔓延并形成优势种群，造成部分地区生态失衡，物种多样性受影响，浮游生物减少，物种多样性丧失，尤其对某些经济贝类影响极大，并威胁某些地区土著植被红树林的生存。这些负面效应亦已引起广泛关注和争议。近年来，针对如何有效控制大米草及互花米草的生长,国内外有相当多的研究4-6。肖强等研究了盐度对互花米草生长中一些生理指标的影响7-8，初步研究了互花米草的抗盐保护机制。张正仁等8观察到互花米草的适盐范围是0% 3%,最适范围在1%左右,致死阈值在5%左右。在盐城地区沿海滩涂实地考察中，我们了解到，大米草在潮水不能进入的地区，其生长受到影响以致死亡。海水的平均盐度为3.5%，近海的盐度略低于这个数值，其中NaCl约占到海水中盐类总量的80。根据Mocledon的人工海水配方(盐度3.34)中，每千克海水中，NaCl为26.726g。本实验将NaCl浓度范围选定在026.726%之间，对不同浓度的NaCl对大米草根系活力，可溶性蛋白含量，谷胱甘肽（GSH）含量，超氧化物岐化酶（SOD）活性，丙二醛（MDA）含量及过氧化氢酶（CAT）活性等生理指标进行比较测定和研究。从而探讨大米草对盐分的调节机制，以期有效控制大米草的进一步扩散，维护沿海地区物种多样性。1实验材料：大米草（Spartina anglica）材料来源：黄海沿海盐城段滩涂材料特点：A、 生物学特征：禾本科大米草属，多年生草本宿根植物，株高一般为3070厘米，最高可达1米多。根系发达，茎秆直立、坚韧、不易倒伏。基部腋芽可萌发新蘖和生出地下茎，在土层中横向生长，然后弯曲向上生长，形成新株。叶互生，表皮细胞具有大量乳状突起，使水分不易透入；叶背面有盐腺，根吸收的盐分大部分由这里排出体外。属泌盐盐生植物，具典型的双细胞盐腺。圆锥花序，长1035厘米，由415枚直立的总状花序组成；小穗含1小花，长1418毫米。511月陆续开花，1012月结实，结实率低。成熟种子易脱落，无休眠期，可被潮水漂流扩散至远近各处。种子失水即死、故主要用分株进行无性繁殖。B、 生理特征：大米草具有很强的耐盐、耐淹特性，能在其他植物不能生长的潮水经常淹到的海滩中的潮带栽植成活，为挺水盐生植物。因它是湿生植物，故耐旱能力差。在海水淹没时间太长、缺少光照的低滩不能生存。大米草密集成草丛，即可抵挡较大风浪。它既能生于海水盐土，也适应在淡水中性土、软硬泥滩、沙滩上生长。分蘖力特别强，在潮间第1年可增加几十倍到100多倍,几年便可连片成草场。耐高温，草丛在气温4042时，若水分充足仍能分蘖生长。不耐倒春寒，当夜温骤降到-10多度时，将被冻死。耐石油、朵酚油的污染，能吸收汞及放射性元素铯、锶、镉等。大米草适生于海滩潮间带的中潮带，在风浪太大的侵蚀滩面则不能扎根。2、实验方法：21材料采集、处理及盐度胁迫培养2.1.1材料采集：采集生长状态良好的大小相近的大米草成熟植株，连根和地下茎挖出，带土，减少根系损伤。2.1.2栽植：采用分株无土栽培法。将大米草每510株为一丛,分别小心清洗根系泥土后栽植于小型塑料容器中，共计18份，栽植深度610厘米。栽后模拟自然环境复壮1周，保证扎根成活。2.1.3盐度胁迫培养：以Hogland溶液为溶剂，按（表一）配制人工海水，再分别加入0g，5g，10g，15g，20g，26.726g的NaCl，配制成系列NaCl六组梯度浓度的人工海水营养液。每组分别三盆重复。使用无土栽培的方式对大米草进行营养液培养，以灭菌后的砂石固定其根部8，9。置光照培养箱中培养，设置恒温24，光照时段为8：00-20：00（每日昼夜各12h），光照强度4000lux。培养过程中，及时更换培养液以使各组盐度达到所设定的水平。处理期9天，期间观测各组生长状况。9天处理结束后，采集对应位置成熟叶及根系测定各项指标。表一（盐度3.34%）单位g/L （H2O）7 名称MgCl2MgSO4CaCl2NaHCO3KClNaBrH3BO3g/L2.263.2481.1530.1980.7210.0580.058名称Na3SiO3Na2Si4O9H3PO4Al2Cl6LiNO3NH3g/L0.00240.00150.0020.0130.00130.00222生理生化指标测定221根系活力的测定：参照张志良的-萘胺氧化法测定 14。以对-萘胺的生物氧化强度（mg -萘胺/gFWh）表示根系活力的大小。222酶液的提取：1称取各盐度培养的植株生长良好的绿色新鲜叶片各0.5g。2材料加入预冷研钵中，加入1ml 50mmol/L PH=7.8的磷酸缓冲液，在冰裕下研磨成浆，移入离心管，加入缓冲液至终体积5ml。3将研磨液10000rpm低温离心10min，收集上清夜，分别分装入5只Dorf管中，标记。4冰箱中冷冻保存，用于后续实验。223可溶性蛋白含量的测定：采用Bradford的考马斯亮蓝G-250法测定15。224谷胱甘肽（GSH）含量的测定：按照南京建成生物工程研究所提供的试剂和说明方法测定。225超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定：参照Giannopolitis等的方法，以抑制NBT光化还原50%为一个酶活性单位16。226过氧化氢酶(CAT)活性的测定：参照Del Rio等的氧电极法进行14，以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。227丙二醛(MDA)含量的测定：参照Heath和Parker的硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定MDA17。丙二醛在酸性和高温条件下，可与硫代巴比妥酸（ TBA ）反应生成红棕色的三甲川（ 3,5,5 三甲基恶唑 2,4- 二酮），该物质在532nm处有最大吸收峰，可用比色法测量丙二醛的含量。3结果与讨论311不同盐度培养对大米草根系活力的影响根系活力=(C1-C2-C)*VT/（t*FW） C为对照组前后的浓度差VT为总体积，等于50ml,t为1h,FW为0.5g。表2-1-1培养植株说用NaCl浓度5minOD值C1(5min后-萘胺法含量ug/ml)1hOD值C2(1h后-萘胺法含量ug/ml)根系活力ug/gh26.7260.540 26.500 0.534 26.100 -60.000 200.53926.30.52225.30150.517250.52225.3-70100.532260.55327-20050.532260.48623.911000.554270.53626.2-20图2-1-1312不同盐度培养对大米草可溶性蛋白含量的影响 标准曲线 牛血清的浓度（g/l）OD值牛血清的浓度（g/l）OD值00000.020.010.20.1220.040.0130.40.230.060.0170.60.3860.080.0230.80.5080.10.02910.688表2-1-2培养植株所用NaCl浓度g/lOD1可溶性蛋白1g/lOD2可溶性蛋白2g/l00.210.320.2420.3850.3020.480.3670.59100.4630.720.4640.72150.4160.640.2950.47200.2230.350.270.4226.7260.4480.70.410.63 图2-1-2313不同盐度培养对大米草GSH含量的影响表2-1-3-1OD值OD值标准管0.102空白管0.050g/l测定管0.1180g/l空白管0.0965g/l测定管0.1315g/l空白管0.10610g/l测定管0.1410g/l空白管0.11215g/l测定管0.115g/l空白管0.07920g/l测定管0.11320g/l空白管0.10126.726g/l测定管0.1426.726g/l空白管0.136提取液中GSH的含量=标准管浓度*（测定管OD-测定空白管OD）/（标准管OD-空白管OD）其中标准管浓度为0.5mmol/l。可得 表2-1-3-2培养植株说用NaCl浓度g/lGSH含量mmol/l00.21250.245100.275150.206200.11826.7260.039 图2-1-3314不同盐度培养对大米草可溶性蛋白含量的影响一个酶活力单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50%）时所需的酶量SOD的总活性=(A0-AS)*VT/( A0*0.5*FW*V1) A0为对照管的吸光值，AS为测定管的吸光值，VT为酶提取液的总体积（ml）；由实验1.2.2可知此处为5ml。V1测定用粗酶液体积（ml）；此处为aml.FW样品鲜重（g）；由实验1.2.2可知此处为0.5g。表2-1-4培养植株所用NaCl浓度g/la=30ul时ODa=30ul时总活力U/ga=50ul时ODa=50ul时总活力U/ga=100ul时ODa=100ul时总活力U/g00.34244.80.2821660.37249.150.34244.80.272174.30.36452.3100.32270.70.2412000.36551.9150.35232.50.301150.20.37547.9200.45110.70.269176.80.41133.326.7260.29312.50.239201.70.35556对照管0.540.4820.493不同盐浓度对大米草SOD活性的影响0501001502002503003500102030培养植株说用NaCl浓度g/l总活力U/ga=30ula=50ula=100ul 图2-1-4315不同盐度培养对大米草MDA含量的影响表2-1-5-1OD值OD值标准管0.081空白管0.0160g/l测定管0.030g/l空白管0.0075g/l测定管0.0175g/l空白管0.00310g/l测定管0.02110g/l空白管0.00415g/l测定管0.01615g/l空白管0.00320g/l测定管0.01620g/l空白管0.00226.726g/l测定管0.01626.726g/l空白管0.003OD值2OD值2标准管0.081空白管0.020g/l测定管0.040g/l空白管0.0095g/l测定管0.0275g/l空白管0.00710g/l测定管0.02210g/l空白管0.00115g/l测定管0.01615g/l空白管0.00220g/l测定管0.01920g/l空白管0.00526.726g/l测定管0.01226.726g/l空白管0.003提取液中MDA的含量=标准管浓度*（测定管OD-测定空白管OD）/（标准管OD-空白管OD）其中标准管浓度为10mmol/l。 表2-1-5-2培养植株说用NaCl浓度g/lMDA含量mmol/l(1)MDA含量mmol/l(2)03.545.0852.153.28102.623.441522.3202.152.326.72621.48图2-1-5316不同盐度培养对大米草CAT活性的影响表2-1-6培养植株说用NaCl浓度g/l0min1min2min3min4min5minCAT的活力U/gmin01.5061.5021.4991.4981.4991.4990.751.7451.7551.7421.741.7381.7351101.9431.9391.9391.9391.9321.9281.5151.4471.4431.4411.4381.4371.4351.2201.2581.2561.2511.251.251.2490.926.7261.871.8661.8571.861.8571.8541.6图2-1-632 讨论我们认为在大米草脱离了原始生活环境（海水均浓度为26.726g/l）时，受到了低盐胁迫后，机体抗氧化防御系统发挥作用，在10g/l浓度下具有最高的抗氧化能力，也有可能具有较高的调节能力，这与正仁等4发现互花米草盐度最适范围在1%左右是一致的；而其他浓度处活性低可能由于受胁迫时消耗有关。GSH含量在10g/l浓度也具有一个峰，但在26.726g/l浓度下含量却最低，这有可能说明在正常情况下，GSH在抗氧化时不是起主要作用，而在胁迫时有重要的抗氧化作用。SOD,CAT属抗氧化酶系统，可以分别除去O2.-，H2O2。GSH是一种低分子清除剂，可清除O2.-，H2O2,它是组织中主要的非蛋白的巯基化合物，能稳定含巯基的酶及其它蛋白酶，使它们免受氧化损伤，从而降低了膜脂过氧化作用。缺乏或耗竭GSH会促使许多化学物质或环境因素对生物体产生中毒作用或加重中毒作用。因而， SOD,CAT活性大小及GSH含量多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。如图2-1-4和图2-1-6所示，SOD,CAT活性随培养用盐度的下降均先降后升再降，并于10g/l浓度处有一个峰，我们认为在大米草脱离了原始生活环境（海水均浓度为26.726g/l）时，受到盐胁迫后，机体生命活动受抑制，其后，由于机体自身调节能力，抗氧化系统被激活，并在10g/l浓度达到峰值，这与正仁等4发现互花米草最适范围在1%左右是一致的。GSH含量在10g/l浓度也具有一个峰，但在26.726g/l浓度下含量却最低，这有可能说明在正常情况下，GSH在自然状态抗氧化时不是起主要作用，而在胁迫时有重要的抗氧化作用。可溶性蛋白的成分主要为各种酶类。本实验主要在0-3%低盐度情况下培养，实验曲线与SOD,CAT活性曲线较一致，可以认为可溶性蛋白含量的变化反映了大米草中抗氧化酶的变化。随盐度降低大米草所含可溶性蛋白下降，可能是因为生命活动受抑制以及细胞调控渗透压的需要；而其后上升至10g/l浓度时含量为峰值进一步说明了在此浓度下大米草具有最高的调控能力。MDA是一种脂质过氧化物。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物，通过链式或链式支链反应放大活性氧的作用。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化而引起细胞的损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞的损伤，因而，MDA的含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞的损伤程度。在本实验中，MDA变化曲线表明：在正常海水浓度下培养大米草的细胞损伤程度最低，随着盐度地降低，细胞损伤程度依次升高，并在0g/l(淡水)浓度下细胞损伤程度最高。此外，SOD、CAT活性和GSH含量以及可溶性蛋白含量在0g/l浓度下均较低，可以说明在此盐浓度下不适合大米草的生长；而在10g/l浓度下MDA的含量也比较高，与此浓度下的高抗氧化能力相矛盾，这可能是由于培养的时间较短（9天），大米草生活环境改变之后还处在适应期间，细胞的早期损伤较大。4结论1SOD、CAT活性和GSH含量以及可溶性蛋白含量在10g/l浓度下均具有一个峰，说明该盐度下植物具有较高的调控能力。2SOD、CAT活性和GSH含量以及可溶性蛋白含量在10g/L盐度以下均下降至0g/L时最低，此阶段细胞损伤程度加深，不适应大米草的生长，因而可以采取用淡水围淹的方法限制大米草的生长。由于实验只能部分模拟野生环境条件，实验结果必然有局限性；材料数量及实验时间限制重复性实验的次数，影响结果的普遍性；只能对大米草属两种植物的生命周期中的某一阶段进行研究，有待进一步研究。参考文献：1 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