两种曲霉糖化质的比较.doc

两种曲酶糖化性质的比较研究生物08本 桑婷婷在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。它们分别是-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产1。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。1 材料与方法11材料菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-412培养基 种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液体深层发酵液）13试剂133%可溶性淀粉；碘液；0.01MNacl-HAC缓冲液；6NHCL；DNS试剂；葡萄糖标准溶液；无菌水14实验用具水浴锅；三角瓶；试管；721型分光光度计；高压蒸汽灭菌锅；电子天平；恒温培养箱；摇床；电炉；酒精灯；吸管；量筒15方法151菌种培养 斜面菌种培养：将米曲霉和黑曲霉分别接种于土豆汁培养基和察式培养基上，于3032下培养47天，待产生孢子后置于5中备用。军种扩大培养：从斜面培养基中挑取一环孢子接种于麸皮培养基上，于3032下培养，待长满孢子后备用。152液化酶和糖化酶的发酵生产孢子悬浮液的制备：挑取经扩培的菌种孢子，接入内含10ml无菌水的试管中，制成孢子悬浮液，并在此基础上，继续稀释成108个/ml孢子悬液。稀释时可利用血球计数板推断选择适宜稀释度的孢子悬液。液化酶和糖化酶的发酵:取5%孢子悬浮液接种于液体深层发酵液中，置于3032，200r/min旋转式摇床上控温发酵，并定期测定酶活力，和PH。153酶活测定粗酶液制备；定期取20ml发酵液经纱布过滤，1000g冷冻离心5min，取上清作为粗酶液。液化酶活性测定；取1.5ml 1.33%可溶性淀粉于60C水浴5Min，加0.5ml酶液（或双蒸水作为空白对照），60反应10min，取O.1ml反应液加入10ml碘液，摇匀后680nm处测OD。每个样品作两个重复。糖化酶（葡萄糖淀粉酶）活性测定；0.1ml1.33%可溶性淀粉加0.1ml酶液（或双蒸水作为空白对照）60水浴反应20min，立即加入1mlDNS试剂，沸水浴5MIN后冷却，加入4.8ml水，在520nm处测定OD值。154发酵液中还原糖含量的测定葡萄糖标准曲线的制作取9支25*25试管，分别按下表加入试剂；项目 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准溶液（ML） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水（ML） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4DNS试剂（ML） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 将各管溶液混匀均匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每官加入21.5ml蒸馏水，摇匀。于520nm波长处测OD值。以葡萄糖MG数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。项目空白还原糖0123发酵液溶液（mL）01.01.01.0蒸馏水（mL）21.01.01.0DNS试剂（mL）1.51.51.51.5加入试剂后，其余操作均于制作标准曲线时相同，测定后，取样品的OD值在标准曲线上查相应的糖量，用下式计算出发酵液中还原糖的含量。还原糖浓度（mg/ml）=（还原糖mg数*稀释倍数）/发酵液体积155发酵液PH测定定期取发发酵液用酸度计测其PH。2 实验结果21酶活测定表1.1 酶活力（U）的变化发酵时间（h）液化酶糖化酶米曲霉黑曲霉米曲霉黑曲霉249.229. 180.850.67489.539.740.900.707215.439.800.960.94969.659.603.513.23从表中数据可以看出，米曲霉具有远比黑曲霉高的液化酶活性，而糖化酶活性测定中发现，米曲霉具有比黑曲霉略高的活性。2.2 发酵液中还原糖含量测定及pH变化图1 葡萄糖标准曲线表1.2 PH，糖的变化发酵时间（h）米曲霉黑曲霉pH还原糖（mg/mL）pH还原糖（mg/mL）244.7419.364.3119.80485.048.224.8916.87726.652.755.666.29967.341.826.674.69从表中数据可看出，黑曲霉还原糖能力明显大于米曲霉，且米曲霉和黑曲霉的糖化酶都比较耐酸，但黑曲霉糖化酶的最大值高于米曲霉。3 讨论从实验数据来看，米曲霉具有比黑曲霉高的液化酶活性和略高的糖化酶活性，黑曲霉具有多种活性强大的酶系，可用于工业生产，如淀粉酶用于淀粉的液化、糖化以及酒精工业或制造葡萄糖和消化剂。产生耐酸性蛋白酶用于蛋白质分解或食品、消化剂的制造。果胶酶用于水解聚半乳糖醛酸、果汁澄清和植物纤维精炼。还有柚苷酶、橙皮苷酶、葡萄糖氧化酶、纤维素酶等。黑曲霉还能分解有机质，产生多种有机酸如抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸等。某些菌系除了在甾体化合物11-a位起羟化作用外，还能将羟基孕甾酮转化为雄烯。此外该菌还常常被用来做微量元素的测定菌和霉腐试验菌,也可用作发酵饲料2。米曲霉能产生淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、溶血酶等，有的已做成酶制剂用于工业生产。有些菌系能产生多种有机酸，许多菌株还能产生大量的曲酸。米曲霉也是酒厂和酱油厂常用的生产菌。本省永春酱油厂还有从酱油曲中分离出产蛋白酶高的优良菌株。米曲霉发酵所加工的产品及食品对人类或动物具有一定的