关于数字 P C R的报告 方昊ppt课件.ppt

1 关于数字PCR发展 原理 运用和前景调查汇报2017年3月 2 数字PCR digitalPCR dPCR 技术是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术 与传统定量PCR技术不同的是数字PCR不依赖于扩增曲线的循环阈值 CT值 进行定量 不受扩增效率的影响 也不必采用看家基因和标准曲线 是对起始样的绝对定量 3 主要内容 数字PCR的发展与原理 数字PCR的应用 3 1 2 数字PCR的前景展望 4 数字PCR的发展与原理20世纪末 Vogelstein等提出数字PCR的概念 通过将一个样本稀释后分成几十到几万份甚至上千万份 然后分配到不同的反应单元 每个单元不包含或包含一个或多个拷贝的目标分子 DNA模板 在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增 扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析 1 2006年美国Fluidigm公司率先推出第一款数字PCR产 基于IFC integratedfluidiccircuit 技术的BioMarkTM 2009年 BioTrove被LifeTechnologies AppliedBiosystems 收购 QuantaLife公司开发出的微滴数字PCR技术 该产品还获得了2011年度Frost Sullivan北美新产品创新奖 同年Bio Rad收购QuantaLife的液滴数字PCR技术 ddPCR 迅速推出QX100液滴数字PCR产品 5 6 传统PCR或定量PCR反应都是在96 384孔板中进行的 因此早期的数字PCR技术也采用96 384孔板作为反应单元 这远远不能满足数字PCR对反应单元数的需求 于是开始制造微升和纳升级别的反应室 在提高灵敏度的同时减少了反应体系的总体积 1 微反应室 孔板数字PCR 7 2 微流控数字PCR随着微流芯片技术的发展 数字PCR借助微流芯片 可以把样本准确并且快速的分成若干个独立的反应单元 各个单元之间互不影响 可以多步反应同时进行 提高反应通量的同时也降低了反应消耗成本 8 3 微滴数字PCR微滴数字PCR借鉴了乳液PCR 即将DNA模板与连接引物的磁性微球以极低的浓度 比如单拷贝 包裹于油水两相形成的纳升至皮升级液滴中进行PCR扩增 扩增后的产物富集在磁性微球上 收集破乳后进行测序 通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的PCR反应体系 比微孔板和IFC系统更容易实现小体积和高通量 而且系统简单 成本低 因此成为理想的数字PCR技术平台 2 数字PCR的应用 9 数字PCR的前景展望发展空间大数字PCR与传统PCR不同它有多种运作方式和原理 数字PCR技术还有很大的发展空间 在其运用方面 也可有有很大的拓展空间 因为他是对核酸的绝对定量 是一种更加直观 精确的PCR技术 在未来的研究中 数字PCR肯定会有更大的发挥空间 10 数字PCR的前景展望高需求并有小众化趋势因为数字PCR在各项领域的突出表现 数字PCR的需求越来越迫切 例如 现在许多医疗机构提供DNA水平的疾病 主要为癌症 筛查服务 并为癌症患者提供靶向药品 虽然国内只有少数医疗机构提供该服务 但是需要这项服务的人却很多 11 2020 1 29 12 可编辑 数字PCR的前景展望发展中的难点成本高通量低对引物有要求DNA聚合酶质量要求高严控污染 13 1 林彩琴 姚波 数字PCR技术进展 J 化学进展 2012 12 2415 2423 2 詹成 燕丽 王琳 金玉麟 陈力 时雨 王群 数字PCR技术的发展和应用 J 复旦学报 医学版 2015 06 786 789 3 HolmbergRC GindlespergerA StokesT etal AkonniTruTip R andQiagen R methodsforextractionoffetalcirculatingDNA evaluationbyreal timeanddigitalPCR PLoSOne 2013 8 e73068 4 GuW KohW BlumenfeldYJ etal Noninvasiveprenataldiag nosisinafetusatriskformethylmalonicacademia GeneticsinMedicine 2014 16 7 564 567 5 PornprasertS PrasingW Detectionofalpha 0 thalassemiaSouth EastAsian typedeletionbydropletdigitalPCR Euro peanJournalofHaematology 2014 92 244 248 14 6 PodlesniyP Figueiro SilvaJ LladoA etal LowcerebrospinalfluidconcentrationofmitochondrialDNAinpreclinicalAlzheimerdisease AnnalsofNeurology 2013 74 655 668 7 GevenslebenH Garcia MurillasI GraeserMK etal NoninvasivedetectionofHER2amplificationwithplasmaDNAdigitalPCR ClinicalCancerResearch 2013 19 3276 3284 8 BeaverJA JelovacD BalukrishnaS etal DetectionofcancerDNAinplasmaofearlystagebreastcancerpatients ClinicalCancerResearch 2014 20 10 2643 2650 9 MaJ LiN GuarneraM JiangF QuantificationofplasmamiRNAsbydigitalPCRforcancerdiagnosis BiomarkInsights 2013 8 127 136 15 10 PersaudD GayH ZiemniakC etal AbsenceofdetectableHIV 1viremiaaftertreatmentcessationinaninfant NewEnglandJournalofMedicine 2013 369 1828 1835 11 AubertM BoyleNM StoneD etal InvitroinactivationoflatentHSVbytargetedmutagenesisusinganHSV specifichomingendonuclease MolecularTherapy NucleicAcids 2014 3 e146 12 AbyzovA MarianiJ PalejevD etal Somaticcopynumbermosaicisminhumanskinrevealedbyinducedpluripotentstemcells Nature 2012 492 438 442 13 BoettgerLM HandsakerRE ZodyMC etal Structuralhaplotypesandrecentevolutionofthehuman17q21 31region NatureGenetics 2012 44 881 885 16 14 HindsonBJ NessKD MasquelierDA etal High throughputdrop letdigitalPCRsystemforabsolutequantitationofDNAcopynumber AnalyticalChemistry 2011 83 8604 8610 15 ShlushLI ZandiS MitchellA etal Identificationofpre leukaemichaematopoieticstemcellsinacuteleukaemia Nature 2014 506 328 333 16 JohnsonBE MazorT HongC etal Mutationalanalysisrevealstheoriginandtherapy drivenevolutionofrecurrentglioma Science 2014 343 6167 189 193 17 MiyaokaY ChanAH JudgeLM etal Isolationofsingle basegenome editedhumaniPScellswithoutantibioticselection NatureMethods 2014 11 291 293 17 18 Abdel WahabO KlimekVM GaskellA etal Efficacyofinter mittentcombinedRAFandMEKinhibitioninapatientwithconcurrentBRAFandNRASmutantmalignancies Cancerdiscovery 2014 4 5 538 45 19 NairVD GeY BalasubramaniyanN etal Involvementofhis tonedemethylaseLSD1inshort time scalegeneexpressionchangesduringcellcycleprogressioninembryonicstemcells MolecularandCellularBiology 2012 32 4861 4876 20 GorbachevAY FisunovGY IzraelsonM etal DNArepairinMy coplasmagallisepticum BMCGenomics 2013 14 726 21 JiangK RenC NairVD MicroRNA 137repressesKlf4andTbx3duringdifferentiationofmouseembryonicstemcells StemCellResearch 2013 11 1299 1313 18 22 GuoG HussM TongGQ etal Resolutionofcellfatedeci sionsrevealedbysingle cellgeneexpressionanalysisfromzygotetoblastocyst DevelopmentalCell 2011 18 4 675 685 23 WhiteAK MichaelV OlehIP etal High throughputmicrofluidicsingle cellRT qPCR ProcNatlAcadSciUSA 2011 108 34 13999 14004 24 CangiMG BiavascoR CavalliG etal BRAFV600E mutationisinvariablypresentandassociatedtooncogene inducedsenes cenceinErdheim Chesterdisease AnnalsoftheRheumatic 2014 doi 10 1136 annrheumdis 2013 204924 25 ChongIY CunninghamD BarberLJ etal Thegenomicland scapeofoesophagogastricjunctionaladenocarcinoma JournalofPathology 2013 231 301 310 19 26 FresardL LerouxS ServinB etal Transcriptome widein vestigationofgenomicimprintinginchicken NucleicAcidsResearch 2014 42 6 3768 3782 27 WangIX CoreLJ KwakH etal RNA DNAdifferencesaregen eratedinhumancellswithinsecondsafterRNAexitspoly meraseII Cellreports 2014 6 906 915 28 ChenR MiasGI Li Pook ThanJ etal Personalomicspro filingrevealsdynamicmolecularandmedicalphenotypes Cell 2012 148 1293 1307 29 LaurieMT BertoutJA TaylorSD etal Simultaneousdigitalquantificationandfluorescence basedsizecharacterizationofmassivelyparallelsequencinglibraries Biotechniques 2013 55 61 67 20 30 WhiteRA GrassaCJ SuttleCA DraftgenomesequenceofExiguobacteriumpavilionensisstrainRW 2 withwidethermal salinity andpHtolerance isolatedfrommodernfreshwatermicrobialites GenomeAnnouncements 2013 1 4 e00597 13 31 MorissetD StebihD MilavecM etal QuantitativeanalysisoffoodandfeedsampleswithdropletdigitalPCR PLoSOne 2013 8 e62583 32 PhilippeC SomanathB LinaP etal AbsolutequantificationofgeneticallymodifiedMON810maize ZeamaysL bydigitalpolymerasechainreaction AnalyticalandBioanalyticalChemistry 2010 396 2143 2150 33BurnsMJ BurrellAM FoyCA TheapplicabilityofdigitalPCRfortheassessmentofdetectionlimitsinGMOanalysis EuropeanFoodResearchandTechnology 2010 21 231 353 362 34 RackiN MorissetD Gutierrez Agu