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光合细菌生产配方的优化研究摘要 本试验选取了 4 种常用的光合细菌培养基, 通过筛选, 得出计数培养基为最佳。再对计数培养基进行优化, 得到最佳生产配方为: 碳酸钠 2.0 g, 乙酸钠 3.0 g, 酵母膏 2.0 g, 磷酸二氢钾 0.5 g, Fe- EDTA 0.005 g, 氯化铵1.0g, 食盐 1.0 g, 六水氯化镁 0.2 g, pH 7.6, 蒸馏水 1000 mL; 该配方生产的活菌数可达 12.5 亿个/mL。同时, 光合细菌生长阶段活菌数与 OD 值的拟合直线方程为 y=4.2255x- 0.6155(R2=0.9532), 为生产上对光合细菌活菌数的检测提供了一种简单快捷的方法。关键词 光合细菌; 培养基; 优化Abstract This study optimized the counting medium from 4 photosynthetic bacteria.The best formula of countingmedium for the production were: sodium carbonate 2.0 g, sodium acetate 3.0 g, yeast extract 2.0 g, potassium dihydrogenphosphate 0.5 g, Fe- EDTA 0.005 g, ammonium chloride 1.0 g, salt 1.0 g, six water magnesium chloride 0.2 g, pH 7.6, dis-tilled water 1000 mL and when the formula was used in the production, viable bacteria counts reached 1.25 billion permilliliter.At the same time, analysis the relationship between photosynthetic bacteria growth phase with viable bacteriacounts and OD value, fitting a linear equation y=4.2255x- 0.6155(R2=0.9532), to offer a simple method for the detecting ofthe number of viable in the production of photosynthetic bacteria.Key words photosynthetic bacteria; culture medium; optimization光合细菌(PSB) 在自然环境下具有固氮、脱氮、固碳、硫化物氧化等多种功能 ( 吴海燕等,2005), 具有广阔的应用前景。研究表明, 光合细菌在温度 28 32 , pH7.6, 光照 1500 3000 lx 条件下生长较好(唐亮和李玉林, 2003; 孙军德等, 2003)。本试验拟对光合细菌培养基组分进行研究, 旨在筛选一种能提高光合细菌活菌数的生产配方。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种 4 株光合细菌 62#、22#、41#、1051#, 由四川农业大学微生态实验室提供。1.1.2 培养基 改良 71#培养基 ( 操玉涛等,2006); 光合细菌计数培养基(刘军义等, 2004); 光合细菌推荐培养基(张伟, 2003); 紫色非硫细菌培养基(万海龙, 2003)。1.1.3 仪器 超净工作台 (苏州安泰空气技术有限公司, 型号: SW- CJ- 2FD, 洁净度 100 级 IS05);酸度计( 成都方舟科技开发公司, 型号: pHS- 5);恒温培养箱(Thermo corporation, 型号: 3111); 分光光度计 ( 上海市尤尼柯仪器有限公司, 型号:UV- 2100); 全自动高压消毒器(Aatell Scientifc,型号: AMA440N); 干燥箱( 中华人民共和国上海市实验仪器厂, 型号: 101- 3); 200 L 的玻璃缸。1.2 方法1.2.1 培养基的筛选 配改良 71#培养基(A)、光合细菌计数培养基 (B)、光合细菌推荐培养基(C)、紫色非硫细菌培养基(D) 各 600 mL, 用 5 %NaOH 调节 pH 为 7.6; 高压灭菌后, 按 5 %比例接种, 在 30 恒温培养箱, 1500 lx 光照强度下, 厌氧培养 10 d。培养期间, 每天取 5 mL 培养液, 测定 660 nm 下的 OD 值, 观察光合细菌生长情况并记录。1.2.2 培养基的优化 将上述所筛选出的培养基进行优化, 研究乙酸钠、酵母膏和氯化钠( 用食盐代替)含量对这 4 株光合细菌生长的影响。在所筛选的培养基中, 配制 300 mL 培养液,在其他成分不变的情况下, 分别调整酵母膏, 食盐和乙酸钠的浓度, 即分别加入不同浓度的酵母膏(3、2、1.0、0.5 g/L), 食 盐 (5、4.0、3.0、2.0、1.0 g/L)和乙酸钠(4、3、2.0、1.0 g/L), 高压灭菌, 接种菌液, 在 30 , 1500 lx 条件下培养 1 周, 测定660nm 培养液 OD 值。1.2.3 生产培养 将筛选优化得到的培养基作为生产配方, 按 5 %接种量将混合菌液接于 200 L的生产营养液中( 玻璃缸装载), 在光照 3000 lx,温度 28 32 下生产培养。观察菌的生长情况,用双层平板法检测活菌数含量(孙军德等, 2001)。1.2.4 光合细菌生长阶段活菌数与 OD 值关系配制所筛选的培养基 600 mL, 调节 pH 7.6, 在121 高压灭菌 30 min 后, 将活化的菌种接入培养基中。在光照为 1000 lx, 30 恒温培养箱里培养。每天采取 5 mL 培养液测定 660 nm 下的 OD值和活菌数。2 结果与分析2.1 配方的筛选结果 光合细菌在 4 种培养基生长过程 中的 OD 值 差 异 显 著 (F=4.61, F0.05=2.86)。其中, B 培养基的 OD 值最大, 且在第 7 天已达到最大 OD 值( 图 1); 而且在 B 培养基中光合细菌对营养物质的利用效果最好, 在培养第 6天, 三角瓶壁已出现了大量的附壁现象, 生成了大量的光合细菌(表 1)。结果表明, B 培养基即计数培养基最有利于光合细菌的生长, 为筛选的最佳配方。2.2 培养基的优化结果 酵母膏、食盐、乙酸钠对光合细菌生长的影响如图 2。酵母膏含量在 2g/L 时, OD 值最高; 食盐含量在 1 g/L 时, OD 值最高; 乙酸钠含量在 3 g/L, OD 值最高。2.3 生产检验结果 在 200 L 的玻璃缸液中, 生产配方为优化的计数培养基, 光合细菌在第七天生长为红棕色悬液, 且有大量附壁现象。搅拌均匀后, 检测活菌数为 12.5 亿个/mL, OD 值达到 2.85。2.4 光合细菌生长阶段活菌数与 OD 值的关系光合细菌生长周期期间, 活菌数与 OD 值的检测结果如图 3。将活菌数与 OD 值作回归分析发现,活菌数与 OD 值间存在极显著的直线回归关系(F=133.38 F0.01=11.26), 且活菌数与 OD 值呈正相关, 拟合方程为 y=4.2255x- 0.6155(R2=0.9532)。3 讨论目前, 光合细菌生产方式较多, 但生产规模较小, 产品质量较差, 多数产品活菌数在 5 亿个/mL图 1 光合细菌在 4 种培养基生长过程中 OD 值变化曲线32.521.510.50OD值0 1 2345678 9 10天数/dA 培养基B 培养基C 培养基D 培养基2.521.510.50OD值0.5 12345含量/(g/L)酵母膏量食盐量乙酸钠量图 2 培养基中 3 种成分的不同含量对光合细菌生长的影响141210864200 0.5 1 1.5 2 2.5 3活菌数/(亿个/mL)OD 值图 3 光合细菌生长阶段 OD 值与活菌数的关系表 1 光合细菌在 4 种培养基生长过程中的现象培养基 现象改良 71#培养基(A)光合细菌颜色由白黄红, 有少量附壁现象计数培养基(B)光合细菌由白黄红棕红, 有大量附壁现象光合细菌推荐培养基(C)培养基含有硫化物, 光合细菌颜色由白黑暗红紫色非硫细菌培养基(D)光合细菌在该培养基生长过程中, 有黑色的代谢产物, 无附壁现象422008 年第 9 期中国饲料以下。许多研究发现, 营养物质的种类和含量是影响光合细菌生长的主要因素。本试验筛选了 4 种光合细菌培养基, 计数培养基中的营养成分最有利于光合细菌的生长。在计数培养基中, 酵母膏、乙酸钠及氯化钠是光合细菌生长必需的营养成分。由于酵母膏、乙酸钠价格较高, 氯化钠在计数培养基中的用量太大, 考虑到实际生产上, 在降低原料成本的同时又要提高活菌数的要求, 对培养基中酵母膏、氯化钠、乙酸钠的用量进行了优化,得到最佳生产配方为: 碳酸钠 1.0 g, 乙酸钠 3.0g, 酵母膏 2.0 g, 磷酸二氢钾 0.5 g, Fe- EDTA0.005 g, 氯化铵 1.0 g, 食盐 1.0 g, 六水氯化镁 0.2g, pH 7.6, 蒸馏水 1000 mL。 将配方进行小规模化生产试验, 效果显著, 光合细菌生长较快。活菌数的检测是光合细菌生产上重要的工作。一般采用血细胞平板在显微镜下直接计数,但这种方法较为复杂, 且准确性不高、费时, 需要7d 左右。本试验拟合了光合细菌生长阶段活菌数与 OD 值的关系, 两者呈显著正相关: y=4.2255x-0.6155(R2=0.9532), 为以后在实验及生产中活菌数的测定提供了一种较为简捷的方法。本试验在配方的优化试验中, 只对酵母膏、食盐和乙酸钠进行了简单的优化比较, 在生产环节上只作了配方的筛选和在 200 L 玻璃缸中的小规模生产, 对影响生产另一因素菌株活性未作检验。因此, 要研究出一个应用于实际中光合细菌规模化生产的最佳方案, 仍需进行大量的工作。参考文献1 操玉涛, 陈刚, 刘力鹤, 等.光合细菌 M- 01 的培养条件优化研究J.生物学杂志, 2006, 23(1) : 26 27.2 刘军义, 汪文龙, 李娟, 等.正交法研究光合细菌计数培养基J.检验检疫科学, 2004, 2(1) : 45 48.3 孙军德, 张恩禄, 赵春燕, 等.沼泽红假单胞菌培养条件研究J.沈阳农业大学学报, 2003, 34(1) : 28 30.4 唐亮, 李玉林.环境因素对光合细菌应用培养过程增殖的影响J.福州大学学报, 2003, 31(2) : 253 256.5 万海龙.光合细菌和硝化细菌的分离鉴定及其产品的初步研究: 硕士学位论文D.重庆: 西南师范大学, 2003.6 吴海燕, 孙淑荣, 单崇华, 等.光合细菌的生物学特性及其应用效果的研究J.吉林农业科学, 2005, 27, 5: 54 56.7 张伟. 北京红篓菌 PHAs积累条件及 PHA 合成酶基因克隆的研究: 硕士学位论文D.北京: 中国科学院微生物研究所, 2003.通讯地址: 四川省雅安市, 邮编: 625014北京福乐维生物技术有限公司北京福乐维生物技术有限公司成立于 2005 年 8 月, 公司凝聚了一批高素质的专业人才, 以中国农业大学为技术依托, 与中国农业大学动物营养研究室建立了长期合作关系。公司拥有一流的生产设备, 标准化的 GMP 车间, 严格的检化验程序, 在质量控制体系方面通过了 ISO9001 和 HACCP 认证, 并严格按照标准建立了质量和安全管理体系, 以先进的管理经验和完善的生产工艺确保产品质量的优越和稳定。随着业务发展, 新的机遇再次出现! 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