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分子实验基本操作培训 余涛 郑勤思2008 4 13 Outline 分子实验基本流程介绍分子实验基本操作的原理 步骤及注意事项总结 分子实验基本流程介绍 感受态的制备 PCR克隆目的片断 酶切及酶切片断回收 电泳 连接 小提质粒并酶切鉴定 电泳 大肠杆菌的培养 转化 分子实验基本流程介绍 感受态的制备 PCR克隆目的片断 酶切及酶切片断回收 电泳 转化 连接 小提质粒并酶切鉴定 电泳 大肠杆菌的培养 分子实验基本操作 大肠杆菌的培养 原理大肠杆菌在37 下在较好较快的进行增殖 4 下则可较好停止代谢 便于保存 长期保存应在 80 用15 20 甘油冻存 由于转入的质粒带有抗性标记 用带有抗生素的培养基即可进行选择性培养 分为固体培养基培养和液体培养基培养 分子实验基本操作 大肠杆菌的培养 Step0 LB培养基的配制 1L培养基含 10gTryptone5gYeastExtract10gNaCl15gAgar 仅在固体培养基中加入 注意琼脂为Agar琼脂糖 Agarose区分 1L去离子水一般一瓶配100 300mLStep0 灭菌 此后一切保持无菌操作 分子实验基本操作 大肠杆菌的培养 固体培养基培养 用于筛选或短期保存菌种 Step1 倒板微波炉加热培养基 室温冷却至60 左右 移入超净台 加入抗生素 1000 的 即需稀释1000倍 摇匀 趁热快速倒入平板 12mL 板 超净台内室温冷却凝固Step2 接种划线法 烧红接种环 冷却 蘸上菌液 在平板上划线 灼烧接种环 多用于菌种保存平铺法 用玻璃刮刀将菌液铺干与平板上 多用于转化 分子实验基本操作 大肠杆菌的培养 固体培养基培养Step3 37 培养箱中培养 注意需要先正置10min 防菌液倒流 再倒置培养 防止染杂菌 注意培养时间不可过长 一般不超过16小时 防止突变株产生 Step4 培养结束后 需放入4 冰箱的 为防止染杂菌 最好用parafilm封口 分子实验基本操作 大肠杆菌的培养 液体培养基培养 用于扩增 Step1 取出适量培养液于锥形瓶或试管 Step2 加入适量抗生素 Step3 将目标菌落挑入培养液 可用接种环或枪头 Step4 将培养液放入37 摇床中培养 转速一般为220rpm 为什么要摇 分子实验基本操作 大肠杆菌的培养 注意事项 无菌操作 抗生素加入的时机及量培养时间 不可过长 返回 分子实验基本操作 感受态的制备 原理 感受态 可接受外来DNA的状态CaCl2法制备 Ca2 可以使膜骨架发生改变 产生膜上的小孔洞 并可使DNA分子结合并进入细胞内 步骤 比较麻烦 属较考验分子操作的实验之一 往往大批量制备 因此不需经常进行 注意事项 感受态制备后应立即冻存于 80 使用时不可反复冻融 返回 分子实验基本操作 酶切及酶切片断回收 原理 限制性内切酶 1 发现于细菌中 用于降解噬菌体的DNA 宿主自身的DNA则被甲基化 2 分为I II III类 常用II类 识别位点与酶切位点一致 3 区别与外切酶活性 内切酶彻底切断DNA双链 外切酶只切其中一链 往往用于DNA复制的实时检验 分类 单切和双切 分子实验基本操作 酶切及酶切片断回收 单切 Step1 酶切体系的选定确定选用的酶 查找对应高效率的buffer 常用的buffer有H M L K T五种 确定要不要加BSAH M L K Tbuffer都有什么 H High M Medium L Low K KCl T Tri AcetateB L G M O H R K Tango T 分子实验基本操作 酶切及酶切片断回收 Step2 配制酶切体系 以10uL体系为例0 5uL内切酶 含50 甘油防冻 1uLBuffer 10 5uL质粒3 5uL去离子水原则 1 甘油含量不可超过总体系5 防止星火性2 质粒可根据具体情况调整3 内切酶切记不可置于常温 分子实验基本操作 酶切及酶切片断回收 Step3 置于37 培养箱中 温育2 4h 用水浴也可以 但可能会使溶液因蒸发而产生浓度不均匀 注意有些特殊的酶所需的条件有所不同 主要是温度条件 Step4 纯化 方法同PCR片段纯化 Step5 电泳检测 分子实验基本操作 酶切及酶切片断回收 双切 Step1 酶切体系的选定确定选用的两种酶 查找对应双切的Buffer 同时看与分别单切的高效buffer是否吻合 确定要不要加BSAStep2 配制酶切体系 与单切类似 但需要注意酶的用量 甘油含量不可超5 Step3 37 温育2 4hStep4 凝胶回收 分子实验基本操作 酶切及酶切片断回收 凝胶回收 即双切后将所需要的小片段重新富集纯化 Step1 电泳 电泳过程中称重一小离心管 Step