注射用兰索拉唑大鼠多次静脉给药一个月毒试验.doc

江苏省药物安全评价中心 方案号： 注射用兰索拉唑大鼠多次静脉给药一个月毒性试验方案试验名称：注射用兰索拉唑大鼠多次静脉给药一个月毒性试验方 案 号： 研 究 号： 机构负责人：专题负责人：QAU负责人：研究单位：联系人：地址：邮编：E-Mail：电话：委托单位：联系人：地址：邮编：E-Mail：电话： 17目 录1、研究一般信息21.1试验目的21.2研究遵循的GLP法规性文件21.3试验日程21.4试验参与人员21.5试验原始资料保存31.6动物伦理与保护32、材料与方法42.1供试品、对照品及溶媒42.2实验系统62.3剂量设计92.4各种指标的检测方法与频率102.5主要试验仪器与试剂122.6动物麻醉及安乐死方法132.7动物尸体及废弃物处理132.8数据统计与处理133、与试验相关的主要SOP144、注射用兰索拉唑伴随毒代动力学试验144.1分组144.2给药剂量154.3采血方式154.4采血时间点15 5、参考文献15试验方案批准页16注射用兰索拉唑大鼠多次静脉给药一个月毒性试验1、研究一般信息1.1试验目的设法发现毒性反应剂量、剂量与毒性关系、中毒表现和程度、主要毒性靶器官或组织及可逆程度等。预测临床研究可能的安全范围和毒性，预先制定防治措施或避免某些有特殊疾病患者的使用，减少临床可能的风险。为临床试验初始剂量和指标的选择等提供重要参数 。 兰索拉唑属于质子泵抑制剂。本药分布于胃粘膜壁细胞的酸性环境后，转变为有活性的代谢物。这种代谢物与存在于酸生成部位的H+-K+-ATP酶的巯基结合，通过抑制H+-K+-ATP酶的活性而抑制酸分泌。本品适用于口服疗法不适用的伴有出血的十二指肠溃疡。本研究对SD大鼠连续一个月（4周）静脉给予供试品注射用兰索拉唑，观察实验动物SD大鼠产生的毒性反应及其严重程度，并观察毒性反应的靶器官，提供无毒性反应剂量，并比较供试品和对照品的毒性大小，从而为临床更安全的用药以及不良反应的监控提供参考信息。1.2研究遵循的GLP法规性文件本试验方案的制定严格按照国家食品药品监督管理局颁布的药物非临床研究质量管理规范（局令第2 号，2003.9）完成1。1.3试验日程详见附录计划表。1.4试验参与人员1.4.1专题负责人 1.4.2试验参加人员 1.4.3动物饲养管理人员 1.4.4供试品管理人员 1.4.5供试品分析人员 1.4.6病理检验人员 1.4.7 临床检验人员1.4.8资料归档人员1.5试验原始资料保存1.5.1实验原始资料保存地点试验过程中：试验资料由专题负责人保管；试验结束后：试验资料及时归档，保存于本机构档案室。1.5.2原始资料内容专题负责人任命书及计划执行通知书；供试品信息；试验方案及变更书；实验动物的有关资料；原始记录、原始数据和资料；质量保证相关资料；总结报告书；其他相关资料。1.5.3下列资料保存到药品上市后五年纸质记录和电子资料保存地点：本中心档案室。联系电话：联系人：实验标本保存地点：本中心标本室。联系电话：联系人：1.6动物伦理与保护本机构实验动物的使用遵循3R（Reduction, RepLacement, Refinement）原则。实验方案在实施前必须得到本机构动物管理与使用委员会伦理审查批准。2、材料与方法2.1供试品、对照品及溶媒2.1.1供试品2.1.1.1名称注射用兰索拉唑2.1.1.2缩写名/代号 无2.1.1.3批号201401082.1.1.4规格30mg2.1.1.5含量/浓度99.1%2.1.1.6理化性质及生物特性白色或类白色疏松块状物2.1.1.7保存条件25，室温2.1.1.8提供单位 2.1.1.9生产单位 生产地址： 2.1.2对照品2.1.2.1名称注射用兰索拉唑2.1.2.2缩写名/代号无2.1.2.3批号201204012.1.2.4规格30mg/支2.1.2.5含量/浓度无2.1.2.6理化性质及生物特性白色或类白色疏松块状物2.1.2.7保存条件25，室温2.1.2.8提供单位2.1.2.9生产单位2.1.3特殊药品2.1.3.1名称乌来糖2.1.3.2缩写名/代号无2.1.3.3批号T201102142.1.3.4规格500g/瓶2.1.3.5含量/浓度98.0%2.1.3.6理化性质及生物特性无色或白色结晶2.1.3.7保存条件室温2.1.3.8生产单位国药集团化学试剂有限公司 2.1.4溶媒 2.1.4.1名称0.9%氯化钠注射液2.1.4.2缩写名/代号无2.1.4.3批号20130424042.1.4.4规格100ml:0.9g2.1.4.5含量/浓度0.9%2.1.4.6理化性质及生物特性无色澄明液体2.1.4.7保存条件密封保存 2.1.4.8生产单位南京小营药业集团有限公司2.2实验系统2.2.1实验动物2.2.1.1种系及品系SD大鼠2.2.1.2等级SPF级2.2.1.3性别及数量240只（60只雌雄各半用于伴随毒代），雌雄各半。2.2.1.4年龄5周2.2.1.5体重范围160-200g2.2.1.6来源及实验动物生产许可证号北京维通利华实验动物技术有限公司 SCXK（京）2012-00012.2.2实验系统选择理由依据化学药物长期毒性研究技术指导原则要求2，SD大鼠为长期毒性试验常用动物，因此本试验选用SD大鼠作为注射用右旋兰索拉唑大鼠静脉给药一个月毒性试验的实验动物。2.2.3实验动物饲养管理2.2.3.1实验动物使用许可证号SYXK(苏)20070022 2.2.3.2饲养场所（房间）本中心屏障系统动物实验室2.2.3.3饲养房间温湿度控制温度：20-25 ； 控制湿度：40-70 %实际温度：2124； 实际湿度：5065 % 2.2.3.4换气次数10-20次/小时2.2.3.5照明工作照明：150-300 Lux； 动物照明：15-20 Lux照明时间： 12小时/天（06:00开灯18:00关灯）2.2.3.6饲养笼具种类规格不锈钢笼具40cm30cm20cm2.2.3.7饲养密度5只/笼2.2.3.8笼具的换新频率笼具每日清洁，托盘、食盆、饮水瓶每周更换消毒2.2.3.9清扫与消毒每日清扫一次，笼具更换清洗后高压灭菌2.2.3.10噪音60DB 2.2.3.11落下菌数落下菌数：3皿 （将普通琼脂培养皿打开后置于实验室中暴露30分钟后，加盖，于37摄氏度恒温箱内培养48小时候计数，个/皿）。 2.2.4饲料2.2.4.1名称全价鼠颗粒饲料2.2.4.2来源江苏省协同医药生物工程有限公司2.2.5饮用水2.2.5.1种类实验动物饮用水2.2.5.2供水方法瓶装灌水，自由饮用2.2.5.3质量检测依据GB/T5750.12-2006、GB/T5750.4-2006、GB/T5750.6-2006、GB/T5750.11-2006进行检测。检测内容包括：总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、菌落总数、色度、浑浊度、肉眼可见物、pH、铁、锰、铜、锌、溶解性总固体、总硬度、游离氯等，检测结果见检测报告。2.2.6动物检疫与驯化2.2.6.1检疫时间7天2.2.6.2检疫地点本中心SPF级检疫/驯化室2.2.6.3检疫内容体重、天然孔、食欲、排泄物以及毛发观察2.2.7动物识别方法根据动物体重按区组随机化分组法进行分组，雌、雄动物分开分组，具体过程如下：在分组当天对所有动物进行称重后按体重分区，再将每个区组内的动物随机分配到不同组别中，雌雄各半。根据耳标号识别，同时按编号程序进行编号。按SOP5.0/ TEC-MAN-*-002-00程序进行编号，千位为性别号：雌性为2，雄性为1，百位为组别号，十、个位为动物数；雌雄分开饲养，每笼5只。每只动物有唯一耳标号，此外为试验操作方便，每笼5只动物可标个位号1-5号，用苦味酸标记，其中左肩为1号，左后肢为2号，右肩为3号，右后肢为4号，背部为5号。2.3 剂量设计2.3.1供试品给药剂量及选择理由本供试品临床拟用剂量通常成年人一次30mg，用0.9%氯化钠注射液100ml溶解后，一日2次，推荐静滴时间30分钟，疗程不超过7天。大鼠静脉给药半数致死量试验结果显示：本供试品注射用右旋兰索拉唑大鼠静脉给药的LD50为221.5（95%CI: 208.7-235.1）。对照组注射用兰索拉唑大鼠静脉给药的LD50为174.8（95%CI:165.2184.9）。依据化学药物长期毒性研究技术指导原则以及相关指导原则要求1，2，本研究分别选择20mg/kg、4mg/kg、3mg/kg作为SD大鼠静脉给药高、中、低剂量组的给药剂量，分别约为大鼠静脉给药LD50的1/10、1/50、1/100，分别约为人临床拟用剂量的7.48、1.95以及1.11倍。另外溶媒对照组动物给予0.9%氯化钠注射液，注射用兰索拉唑对照组选择20 mg/kg作为给药剂量，以上各组动物的给药体积均为1.5ml/100g体重。具体给药方案和各组动物数量、性别如表1所示。表1. 注射用右旋兰索拉唑大鼠多次静脉给药一个月毒性试验剂量设计及分组组别剂量(mg/kg/day)动物数动物编号溶媒对照组 0*301001-10152001-2015低剂量组3301301-13152301-2315中剂量组4301201-12152201-2215高剂量组20301101-11152101-2115注射用兰索拉唑对照组20301401-10152401-2415“*”表示阴性对照组给予0.9%氯化钠注射液；给药体积均为1.5ml/100g。2.3.2供试品配制2.3.2.1配制方法供试品注射用右旋兰索拉唑：先每瓶中加入7.5ml0.9%氯化钠注射液，配制成浓度为4mg/ml的母液，然后根据1：3和1：10距间比稀释成浓度为1.3mg/ml、和0.40mg/ml的溶液，并贴标签备用。对照品注射用兰索拉唑：每瓶中加入7.5ml0.9%氯化钠注射液，配制成浓度为4mg/ml的溶液，并贴标签备用。2.3.2.2配制地点供试品配制室，超净工作台2.3.3供试品给药途径、方法、频率及期限给药途径：静脉注射给药方法：尾静脉推注给药频率及期限：每天1次，连续4周。2.3.4供试品给药体积1.5ml/100g体重2.3.5给药方式选择的理由本供试品临床拟用途径为静脉注射，所以本试验采用与临床相同途径2.4各种指标的检测方法与频率2.4.1一般症状观察整个实验期间，每天观察动物症状一次，包括外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便等，对异常情况详细记录。2.4.2摄食量每周加食、称剩食并计算摄食量一次。摄食量以笼为单位称取，并折算成g/只/天。2.4.3体重每周称体重一次。2.4.4 临床检测：给药末期（第4周）和恢复期（恢复2周）各测一次。12.4.1血常规测定项目：白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞比积（HCT）、红细胞平均体积（MCV）、平均血红蛋白含量（MCH）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞体积分布宽度（RDW）、血小板总数（PLT）、血小板平均体积（MPV）、血小板体积分布宽度（PDW）、血小板比积（PCT）、网状红细胞百分比（Retic）、中性粒细胞百分比（NEUT%）、淋巴细胞百分比（LYMPH%）、单核细胞百分比（MONO%）、嗜酸细胞百分比（EOS%）、嗜碱细胞百分比（BASO%）、未染色大细胞百分比（LUC%）、高核酸浓度网状红细胞比率（H-RTC）、中核酸浓度网状红细胞比率（M-RTC）、低核酸浓度网状红细胞比率（L-RTC）。12.4.2血液生化测定项目：天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、总胆红素（TBI）、肌酐（CREA）、总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、肌酸激酶（CK）、-谷氨酰转移酶（GGT）。12.4.3血清电解质测定项目：钠（Na+）、钾（K+）、氯（Cl-）。12.4.4凝血时间测定项目：凝血酶原时间（PT）、部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白酶时间（Fbg）、凝血酶时间（TT）。2.4.5麻醉、处死、解剖给药结束（第4周）每组各麻醉处死20只大鼠，雌雄各半；恢复期结束每组各麻醉处死10只大鼠，雌雄各半。所有按计划需要定期解剖的SD 大鼠均用20乌来糖腹腔注射麻醉后，腹主动脉放血处死，并对其进行详细的肉眼观察和完整、系统的剖检并作如实的记录。2.4.6大体观察外观主要观察体型是否正常，有无肥胖或消瘦；观察皮毛有无光泽，是否有脱毛及皮肤溃疡现象；体表有无肿瘤、皮下有无血肿、脓肿等；口角周围有无分泌物；肛门周围有无污物，如有阐明其性质如何。腹腔、胸腔、颅腔主要观察有无粘连、积液以及肿瘤等，如有积液需观察液体的颜色、透亮度及粘稠度，以判断其性质。脏器主要观察其外形、大小、颜色、光泽、质地以及是否有无肥大、萎缩或缺失。2.4.7脏器称重和脏器系数对脑（包括大脑、小脑、脑干）、胸腺、心脏、肺（包括主支气管）、肝脏、肾脏、肾上腺、脾脏、卵巢、睾丸、附睾等脏器进行称重，除肾上腺和卵巢的计算公式为 (脏器重量/体重)1000%，并计算相对脏器重量系数，其余计算公式如下：相对脏器系数=脏器重量100%体重2.4.8组织病理学检查对下列器官组织：心、主动脉、气管、肺、肾、膀胱、脑（大脑、小脑、脑干）、脊髓（颈、胸、腰段）、坐骨神经、食管、胃、小肠、大肠、唾液腺、肝、胆、胰、脾、胸腺、肠系膜淋巴结、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、睾丸、附睾、前列腺、卵巢、子宫、乳腺、胸骨和给药局部进行组织病理学检查。上述器官经12%福尔马林溶液固定，常规取材、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜检查、拍照。根据病变由轻到重的程度，依次标记为“+”、“+”、“+”、“+”，极轻度病变标记为“”，无明显病变标记为“”。2.5主要试验仪器与试剂2.5.1试验仪器试验中所用主要试验仪器信息见表2。表2. 注射用兰索拉唑大鼠多次静脉给药一个月毒性试验主要仪器信息仪器名称型号生产厂家仪器编号全自动血液分析仪ADVIA-120BAYERAPP-TOX-006全自动生化分析仪Dimension XpandDADE BEHRINGAPP-TOX-005全自动凝血分析仪CA-1500SYSMEXAPP-TOX-007Na+/K+/Cl-分析仪EasylyteMedicaAPP-TOX-003自动染色机ST4040LeicaAPP-PAT-004自动脱水机EG1140CLeicaAPP-PAT-001自动包埋机EG1140HLeicaAPP-PAT-002光学显微镜BX41OLYMPUSAPP-GEN-0212.5.2试剂试验中所用主要试剂信息见表3。表3. 注射用右旋兰索拉唑大鼠多次静脉给药一个月毒性试验主要试剂信息试剂名称生产厂家生产厂家GEA测试试剂盒Siemens Healthcare DiagnositicGLU测试试剂盒Siemens Healthcare DiagnositicAST测试试剂盒Siemens Healthcare DiagnositicALP测试试剂盒Siemens Healthcare DiagnositicTBIL测试试剂盒Siemens Healthcare DiagnositicBUN测试试剂盒Siemens Healthcare DiagnositicTP测试试剂盒上海科华生物工程股份有限公司CK测试试剂盒上海科华生物工程股份有限公司-GT测试试剂盒上海科华生物工程股份有限公司TG测试试剂盒上海科华生物工程股份有限公司ALB测试试剂盒上海科华生物工程股份有限公司CHO测试试剂盒上海科华生物工程股份有限公司ALT测试试剂盒上海科华生物工程股份有限公司PT测试试剂盒Siemens Healthcare DiagnositicAPTT测试试剂盒Siemens Healthcare DiagnositicFbg测试试剂盒Siemens Healthcare DiagnositicTT测试试剂盒Siemens Healthcare Diagnositic钠/钾/氯检测试剂包MEDICA CORPORATIONAutoreticSiemens Healthcare DiagnositicEEKLEENSiemens Healthcare DiagnositicPerox sheathSiemens Healthcare DiagnositicPerox1Siemens Healthcare DiagnositicPerox2Siemens Healthcare DiagnositicPerox3Siemens Healthcare DiagnositicRBC/PLTSiemens Healthcare DiagnositicHGBSiemens Healthcare DiagnositicBASOSiemens Healthcare Diagnositic2.6动物麻醉及安乐死方法20%乌来糖麻醉（0.5ml/100g体重）后腹主动脉放血处死2.7动物尸体及废弃物处理试验结束后，按SOP5.0/ ALM-MAN-EVM-024-00对动物尸体以及其它试验废弃物做相应的处理。2.8数据统计处理采用spss13.0统计学软件对试验数据进行相应统计分析,具体过程如下：对于体重、摄食量、血液学指标、血液生化学指标、血清电解质指标、凝血时间指标以及脏器系数等定量数据指标均按照以下方法统计分析：首先用Levene检验方法进行数据均一性检验，如果数据均一（检验P0.05），则进行方差分析检验（F检验）；如果Levene检验的结果显著（P0.05），则进行Kruskal-wallis 检验。如果方差分析检验结果显著（P0.05），则进一步用Dunett参数检验法将各供试品组与对照组进行多重比较检验；如果方差分析结果不显著(P0.05)，则统计结束。如果Kruskal-wallis检验结果显著（P0.05），则进一步用Dunett非参数检验法进行多重比较检验；如果Kruskal-wallis 检验结果不显著(P0.05)，则统计结束。3、与试验相关的主要SOPSOP5.0/ TEC-MAN-RAT-003-00 大鼠静脉注射给药方法SOP5.0/ TEC-MAN-*-002-00 实验动物分组、编号和标识SOP5.0/ TEC-MAN-*-003-00 实验动物症状观察SOP5.0/ TEC-MAN-*-004-00 实验动物摄食量称量