兰州百合的植物组织培养.doc

兰州百合的组织培养技术一、实验目的1、学习并掌握植物组织培养技术2、应用植物组织培养技术快速繁殖兰州百合3、通过以百合鳞片为外植体进行组培，掌握对试验材料的消毒、接种方法，初步掌握外植体愈伤组织诱导的方法。二、实验原理 植物组织培养再生植物的理论基础是细胞全能性，是指在多细胞生物中每个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因，具有发育成完整个体的潜力。 离体的植物组织在一定条件下，可发生“脱分化”，即已经分化了的植物细胞重新分裂生长，形成均一的无组织结构的细胞团，即愈伤组织。这种愈伤组织在一定条件下，又能“再分化”出根和芽等器官。在该过程中，植物生长调节物质起着决定作用，调控愈伤组织的芽或根的分化。三、材料1、试剂：NH4NO3, KNO3, CaCl22H2O, MgSO47H2O, KH2PO4, KI, H2BO3， MnSO44H2O, ZnSO47H2O, Na2MoO42H2O, CuSO45H2O, CoCl26H2O, Na2EDTA2H2O，FeSO47H2O，烟酸，甘氨酸, 盐酸硫胺素, 肌醇, 盐酸吡哆醇；琼脂，蔗糖，蒸馏水，NAA，6-BA，1mol/LHCl，1mol/LNaOH；升汞。2、仪器: 冰箱，天平，酸度计或pH试纸， 电炉，微波炉，高压灭菌锅，烘箱，超净工作台，光照培养箱等3、基本工具：三角锥瓶、容量瓶、吸量管、量筒、移液器、烧杯、培养皿、滤纸、牛皮纸、封瓶膜、玻璃棒、镊子、剪刀等。4、生物材料：市售兰州百合。四、方法（一）MS培养基的配制1.配制MS培养基母液的配制方法如下： (1)大量元素的配制（10）：按母液配制表1上的量依次称取KNO319g、NH4NO3 16.5g、MgSO47H2O 3.7g、KH2PO4 1.7g ,分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，以防互相发生反应，最后用容量瓶定容至1L（如需求量不大可按比例减少）,转入棕色试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。 (2)钙盐的配制：称取CaCl22H2O 4.4g，用少量的蒸馏水充分溶解，最后用容量瓶定容至1L（如需求量不大可按比例减少）,转入棕色试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。 (3)微量元素的配制：依次称取MnSO44H2O22.3g、ZnSO47H2O 8.6g、H3BO3 6.2g、KI0.83g、Na2MoO42H2O 0.25g、CuSO45H2O 0.025g、CoCl26H2O 0.025g ,分别用少量的蒸馏水彻底溶解，再将它们混溶，最后用容量瓶定容至1L（如需求量不大可按比例减少）,转入棕色试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。 (4)铁盐的配制：将称好的FeSO44H20和Na2EDTA分别放到450ml蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5 ，最后用容量瓶定容至1 L（如需求量不大可按比例减少）,保存在棕色玻璃瓶中,贴上标签，置冰箱冷藏保存。 表 培养基母液的配制母液种类药品成分规定量（mg）扩大倍数称取量（mg）母液体积（ml)配1L培养液吸取量（ml）编号种类1大量元素 NH4NO3190010190001000100KNO3165016500MgSO47H2O3703700KH2PO417017002钙盐CaCl22H2O44010440010001003微量元素MnSO44H2O22.31002230100010ZnSO47H2O8.6860H3BO36.2620KI0.8383Na2MoO42H200.2525CuSO45H2O0.0252.5CoCl26H2O0.0252.54铁盐Na2EDTA37.301003730100010FeSO44H2027.8027805有机成分甘氨酸2.005010050010盐酸硫胺素0.105盐酸吡哆醇0.525烟酸0.525肌醇1005000 (5)有机成分的配制: 依次称取甘氨酸2.00g、盐酸硫胺素 0.10g、盐酸吡哆醇0.5g、烟酸0.5g,肌醇100g，用少量蒸馏水充分溶解，最后定容至1L（如需求量不大可按比例减少）,转入棕色试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。 2.激素溶液的配制 分别称取6-BA、NAA各10mg，将6-BA用1ml的0.1mmol/L的NaOH溶液溶解，将NAA用1ml无水乙醇预溶，溶解过程用水浴锅加热，待溶解完全后，分别用容量瓶定容至100ml，即得到0.1mg/ml的母液（实验时按需要量取）。3. 完全培养基的制备（如需求量不大可按比例减少）。 （1）取出母液并按添加顺序放好，将实验所需的量筒，移液枪，烧杯，移液管，吸耳球和玻璃棒等放在实验台上，以备实验所需。 （2）取一干净的烧杯，加入1/3左右（配制培养基总量的1/3左右）的蒸馏水，按顺序加入各种母液，边加边搅拌。 （3）然后按3的含量称取蔗糖倒入并搅拌溶解。 （4）初代培养基按MS+0.5mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA。用移液枪精确量取所需激素母液，加入培养基中。 （5）将上述溶液移入容量瓶中，加蒸馏水定溶。 （6）将定容好的培养基倒入烧杯中，按0.8称取琼脂粉，倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热，直到琼脂粉完全熔化溶液透明（不能一直放在电炉上加热，沸腾了就要取下来晃一晃，再放上去加热，如一直加热烧杯底部会糊且溶液易溢出量会减少）。 （7）用精密试纸调整pH至5.8-6.0。用配制好的0.1mol/L的HCl和0.1mol/L的NaOH溶液来调节pH值（不宜在加热前调节pH，因为加热会使pH改变）。 （8）稍微冷却后，分装入以洗净的三角培养瓶中。再用透明塑料封口膜以及牛皮纸封口，最后用绳子扎紧。 （9）另取适量滤纸（2张/组）、培养皿（2套/组），用牛皮纸包好扎紧；另取蒸馏水适量（至少200ml/组/瓶）装入盐水瓶,盖好塞子并插上针头透气；另取大中小镊子和剪刀等包好（1套/组）。 （10）将步骤8、9所准备的物品统一放入高压锅内，120KPa灭菌30min左右。灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固，将其他实验用具放入干燥箱烘干，放入超净台备用。 （二）兰州百合外植体灭菌处理和初代培养 将买来的新鲜兰州百合的鳞茎拨开，洗去上面的泥土，在用流动的自来水冲洗2h，用前再用蒸馏水洗1-2遍（如买来的百合不能及时用应放到4度冰箱保存）。在超净工作台上采用0.1%的升汞溶液侵泡15min，无菌水冲洗4-5次，进行外植体消毒处理。然后放在无菌滤纸上，无菌剪切成0.5cm1cm大小的小块，凹面向上，接种于培养基上。每组接种2瓶，每瓶接种3块外植体。培养条件：22-25;光照12h/d，光照强度1800-2000lx。每隔两天进行观察和记录生长情况，两周左右鳞片的颜色会发生变化，由刚开始的白色慢慢有点变紫色，培养20天左右鳞片由淡绿色慢慢变为绿色，鳞片凹面的边缘处和中间会有很多突起，当突起慢慢变成0.5-2.0cm左右的绿色小芽时，进行继代培养。 （三） 继代培养 本实验的继代培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖。操作方法如下： 在无菌条件下取初代培养的不定芽，接种在已配制好的继代培养基内进行培养。每两天进行观察记录生长情况，培养10-20d后观察增殖情况，并对生长状况（判定标准：健壮：丛芽质量好，芽生长快；较壮：叶片较整齐，叶色翠绿；一般：丛芽过于紧密，生长慢；细弱：叶片卷曲，单芽质量很差）作出评价。 （四） 生根培养 本实验是以1/2MS+0.2mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+50g/L蔗糖作为生根基础培养基进行试验。方法如下：在无菌条件下将高1cm以上的增殖芽从丛生芽块上切成单株作为生根苗(不要留愈伤组织)接种到配置好的生根培养基中进行培养。每隔两天进行观察记录生长情况，培养2