性病实验室检测的技术标准和操作规程[1].doc

江干区人民医院性病实验室检测操作规程参照标准 1、医疗机构性病门诊规范化管理资料汇编，2、试剂相关说明书2010.12.1目 录一、淋病检查的实验室技术2(一)分泌物涂片检查2（二）淋球菌的分离培养3（三）淋球菌的保存4（四）氧化酶试验5二、支原体的检测5三、衣原体检查6四、梅毒的实验室检测7(一)直接镜检8（二）非特异性梅毒螺旋体试验8五、TPHA梅毒螺旋体血凝试验9一、淋病检查的实验室技术(一)分泌物涂片检查急性淋菌性尿道炎患者常有大量脓性分泌物。在有些脓细胞内可见革兰氏染色呈阴性的双球菌，椭圆或球形，常成双排列。因形态特殊，可取患者尿道分泌物制成涂片后染色，检查有无典型细胞内革兰阴性双球菌，可作为初步诊断的依据。标本采集尿道分泌物、宫颈粘液、尿的离心沉淀物。涂片镜检涂片后，待自然干燥后，加热固定，行革兰氏染色，油镜观察。结果在急性患者的尿道脓性分泌物革兰染色涂片中，常可见到大量红色多形核白细胞，有些细胞中吞噬有淋球菌。多数多形核白细胞中并不含淋菌，但不少细胞中常含有1对或数对，甚至2030对。淋球菌常存在于细胞浆内。在病期较长或经过治疗的淋病患者的涂片中淋球菌比较少，有时呈单个、四联和八叠状，且常位于细胞外。对有些细菌难以下结论时，需进行培养和鉴定。注意事项1涂片时不要用力涂擦，而应将棉拭在玻片上轻轻滚动。涂擦过重，细胞容易破裂变形，致细菌从胞内溢出。2涂片厚薄适宜。过厚，加之染色过程中脱色时间不足，革兰染色易呈紫色。因此，脱色时间要视涂片厚薄而定。3固定涂片时，迅速通过火焰23次，避免加热过度使细胞变形。热度以不烫手为宜。4不推荐用涂片检查来诊断淋菌的直肠和咽部的感染，也不推荐用来作判愈。方法评价涂片检查方法简便、有效、价格低廉且有一定的敏感性和特异性。但其特异性随取材部位的不同而有所不同。男性尿道取材特异性较高，而从女性子宫颈取材特异性较低。因此，世界卫生组织不推荐用涂片法来诊断女性患者。革兰氏染色（一）操作步骤1. 细菌涂片须经火焰固定。2. 先用甲液滴加在标本上，加的量以盖住标本为准，再加等量的乙液，混匀，染3-5秒，用自来水从玻片的一端冲去染液，甩干。3. 滴加适量碱性碘液在标本上，3-5秒后，自来水冲洗，甩干。4. 丙酮酒精脱色，脱色的标本为：当丙酮酒精滴加在标本上，不出现蓝色或淡紫色为宜。5. 用碱性复红复染，覆盖标本，3-5秒后，自来水冲洗，待其自然干燥或用吸水纸吸干，油镜观察。 （二）淋球菌的分离培养如果标本中有淋球菌，则在合适的培养基上经培养后可长成菌落。各种细菌在培养基上生长的菌落形态各不相同。根据菌落的大小，表面高起或扁平、光泽、色素和边缘的情况等，作为细菌鉴定的标准。 1方法 （1）取材培养要取得成功，取材部位和方法要准确。由男性患者前尿道取材时，应该用细小拭子伸入尿道口24cm，取出的分泌物应略带粘膜。从女性患者宫颈取材时，应先用温水湿润扩阴器（不能用液体石蜡等润滑油）。应让棉拭充分吸附分泌物。从直肠取材时，应将棉拭插入肛门2.5cm以上，如果棉拭碰到粪便，应换一个棉拭重取。检查淋菌性咽炎时，应从扁桃体及扁桃体窝取材。为了提高阳性率，可同时取二份标本进行培养。（2）培养基由于淋球菌的营养要求复杂，所用的培养基中应含有动物蛋白及细菌和生长所需的多种因子。目前国内常用的是血液琼脂或巧克力琼脂。为抑制杂菌，在培养基中可加入少量抗菌素和淋球菌增菌剂，使大多数杂菌被抑制而淋球菌菌落长得较大，在平皿中几乎呈纯培养，从而提高分离的阳性率。（3）培养条件淋球菌对外环境变化颇为敏感，对寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，取材后应立即接种。接种的平皿应先放在37温箱中预温。培养的最适温度为3536，超过38.5或低于30便生长不良。最初从人体分离时，需用5%二氧化碳环境，为保持一定的湿度，可在培养缸中放些湿棉球。 2结果淋球菌平皿上经2448小时的培养后，可形成椭圆形、凸起、浸润、光滑、半透明或灰白色菌落。边缘呈花瓣状，用接种环触之有粘性。如继续培养，菌落面积增大，表面变得粗糙，边缘出现皱缩。从菌落上取材涂片，形态有25%较为典型，其他75%为单球菌、四联形或八叠形。 3注意事项 （1）取材是培养获得成功的关键。因为淋球菌好发于柱状上皮细胞，取材深度一定要够，女性患者取材时，将棉拭插入宫颈管，转动并停留1030秒，蘸取少量粘膜，阳性率才高。 （2）对症状不典型的男性患者，最好是在晨起排尿前或排尿后23小时后取材。必要时做前列腺按摩取材。 （3）对女性淋病的检查主张用淋球菌培养。 （4）观看菌落特征最好在36小时左右。培养24小时，菌落小，难以辨认其特征。超过36小时，菌落特征也会有较大改变。 4方法评价培养法对男性及女性标本都是适用的，是世界卫生组织推荐筛查淋病患者的唯一方法，也是诊断淋病的金标准。（三）淋球菌的保存淋球菌在巧克力琼脂或血琼脂上需每天传代，将血液琼脂上的培养物洗于无菌的脱脂牛奶中，存放于-25冰箱可保存2个月，于-70，可保存1年，如保存于液氮中，可无限期保存。也可将细菌洗于30%甘油肉汤培养基（甘油30mL，营养肉汤70ml，121灭菌15分钟）0.5ml中，低温冷冻；或将菌种于巧克力琼脂斜面，36培养过夜后以灭石蜡覆盖，盖好盖后放37保存。使用时只需从斜面上刮下少许淋球菌进行传代培养，不必将石蜡倒掉。淋球菌在37可存活6个月以上。（四）氧化酶试验淋球菌具有氧化酶，能使氧化酶试剂氧化，出现颜色反应。1、称取氧化酶试剂（盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺）0.1g，溶于10ml蒸馏水中。装于棕色小瓶，冰箱保存备用。2、在混有杂菌的淋球菌分离平皿上，如发现有符合淋球菌特征的菌落，可在其上滴加氧化酶试剂一滴，如菌落在接触氧化酶试剂1015秒钟内出现红色并保持30秒钟以上（最后变成黑色）者为氧化酶试验阳性。3、也可先将试剂滴在一张滤纸上，然后挑取可疑菌落与之接触，或先将菌落涂在滤纸上再滴加试剂，观察有无红色出现。菌落显红色为阳性。4、氧化酶试验对快速鉴定淋球菌有一定意义。淋球菌氧化酶试验阳性，但氧化酶阳性的不全是淋球菌。为了保证有良好的反应，不要使用过分陈旧的氧化酶试剂，正常的氧化酶试剂应为粉红色，如试剂已成灰黑色，说明已失效而不应再使用。试剂配好后应避光保存并尽快用完，因此，每次不要多配。氧化酶试刘遇铁也会出现红色而造成假阳性，因此，操作用的接种环最好用铂丝做成，在用其它材料时应检查未挑菌落的接种环在接触沾有试剂的滤纸时是否有红色出现。二、支原体的检测 支原体是介于病毒和细菌之间的一类无细胞壁,能用非活体细胞进行培养的最小微生物。人类支原体均属支原体科范畴，共有14种。其中有常引起呼吸道感染的肺炎支原体，常引起泌尿生殖道感染的解脲支原体(UU)和人型支原体(Mh)。实验室检查一、标本采集棉拭或疑有感染的分泌液等。由于支原体对热及干燥很敏感，故宜及早接种。二、分离培养及鉴定解脲支原体含有脲酶，以尿素为能量来源，分解尿素产生NH4+使培养基变碱，人型支原体能利用精氨酸释放氨，在含有酚红指示剂的液体培养基中使培养基颜色由黄变红。三、设备及材料1、液体培养基内含牛心浸液，小牛血清，新鲜酵母浸膏，0.05%尿素，0.002%酚红和抗生素2、普通恒温培养箱四、操作用无菌微量移液嘴吸取50ulEPS于培养基中或是把棉拭放入培养基中混匀挤干后取出，37，24-48小时观察结果。五、结果判断阳性：透明玫瑰红（或稍有混浊）阴性：黄色或桔黄色；混浊粉红色可能由细菌污染也多为阴性。六、方法学比较支原体直接镜检的意义不大，其形态难与组织细胞或渗出液中的其它颗粒相区别，故不利于临床诊断。用特异性抗体鉴定支原体及血清学分型的方法有生长抑制试验、补体结合试验、荧光免疫反应，但是目前还没有理想的诊断支原体感染的血清学方法，确证必须进行分离培养和鉴定。在固体培养基上UU生长成微小油煎蛋状菌落，需用Dienes染色后用光学显微镜观察才能看清楚。三、衣原体检查衣原体：是介于细菌与病毒之间的，专性真核细胞内寄生的原核细胞型微生物。其主要特征是具有独特的发育周期，在宿主细胞内能形成光学显微镜可见的细胞内包涵体。衣原体一共有15种血清型，其中可引起男女泌尿生殖系疾病的是DK型。实验室检查标本采集：标本选送的正确与否，直接影响到阳性分离率。因衣原体感染女性子宫颈柱状上皮细胞和男性尿道上皮细胞，为确保采集到足够的标本量，应将棉拭沿表面反复滚动10-30秒，女性避免与阴道接触，男性在标本采集之前一小时内不应小便。采集时必须从上皮部位用力拭刮，脓性分泌物不适用于衣原体检查，应先清除后再采样。抗原检测：斑点免疫层析法原理：标本窗的吸收垫含有免疫金复合物（含有抗衣原体属特异性脂多糖表位和乳胶标记的单克隆抗体-小鼠IgG），测试区包被有特异的抗衣原体抗体，提取液使标本窗的免疫金复合物复溶，若待测物含有衣原体抗原则与之结合，并向膜条渗移，在测试区被固相抗体所获，显出反应线，过剩的复合物继续前行，至参照区与固相抗小鼠IgG结合，显出质控线。反之，阴性标本，仅显示质控线。试剂准备1. 将样品处理管放在工作台上，加入6滴溶液A。2. 将采样拭子放入含有溶液A的样品处理管中，室温放置，在处理过程中不断旋转并在管壁挤压拭子，尽量使液体流出，重复多次处理2分钟。3. 然后加入6滴溶液B，旋转拭子，尽量使液体流出，然后按感染物品的处理方法将拭子丢弃。4. 处理后的样品如在60分钟内使用，并不影响试剂盒的检测结果。5. 注意：用A、B液处理样本拭子滴加的溶液量应相等。操作程序1. 请在操作前仔细阅读检测试剂盒说明书。2. 将检测试剂盒从密封袋中取出，放置在洁净、干燥和水平的工作台上，标明样品编号或名称。如果检测试剂盒保存于低于室温处，须将检测试剂盒及试剂提前取出，放至室温后方可使用。3. 将样品处理管中已处理的样品滴加23滴至检测试剂盒的加样孔中。4. 等待结果的出现。加样10分钟时可判读结果。红线显示的时间根据拭子所采集衣原体含量的不同而变化，有些阳性样品可在60秒钟后出现结果。为了确保阴性结果，请勿在15分钟后判读结果。结果：1. 阴性结果：仅质控区（C）有一条红线，检测区（T）无红线出现。2. 阴性结果：除质控区外，另有一条红线出现在检测区（T）。3. 无效结果：质控区不出现红线，则结果无效。应更换新的检测试剂盒重复实验。可用剩余的已处理的样品或重新取样。4. 注意：当检测线很强时，质控线可能相对减弱，此属正常现象。临床意义：作衣原体诊断的参考。结果阳性表示病人可能有衣原体感染，但需结合临床症状全面考虑。注意事项：本试验敏感性为87%，特异性为98.8%。标本中需有一定量的抗原，提取的抗原量低于试验敏感性时可出现假阴性。故试验结果阴性时，不能完全排除有沙眼衣原体的感染，这与标体采集的数量不足有关。操作简便但敏感性差，且受实验人员的主观影响大，技术水平要求高。易把某些发光颗粒（白细胞、上皮细胞、色素颗粒）误认为沙眼衣原体。四、梅毒的实验室检测梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema palidum)感染引起的性传播疾病.梅毒螺旋体长6-20um,宽0.09-0.18um，有规则密螺旋，人工培养很难成功。目前的实验室诊断主要有：皮肤黏膜损伤时用显微镜暗视野镜检，非梅毒螺旋体血清试验和特异性梅毒螺旋体试验。结合临床可对梅毒作出肯定、推断和提示三种判定。临床怀疑为梅毒的病人，一般先进行梅毒常规筛选实验。(一)直接镜检1、标本采取对于一期、二期梅毒可采取病灶分泌物，淋巴结穿刺物或活检组织。三期梅毒取活检组织做检察。在硬下疳皮肤粘膜取材，需先用浸或生理盐水的棉花球轻轻檫去覆盖的枷皮，然后用玻片沾取渗出液。在淋巴结取材，则先用针头穿入淋巴结，注入少量生理盐水，再吸取少量淋巴液。取材后应立即送检。2、器材暗视野显微镜3、操作先用高倍镜寻找，再转换为油镜观察。在镜下找到小而纤细，呈紧密规则的螺旋及特征性的螺旋状运动即可确诊。（二）非特异性梅毒螺旋体试验非特异性梅毒螺旋体试验包括性病研究实验室试验（venereal disease research laboratory test，VDRL），不加热血清反应素试验（unheated serum reagin test,USR）和快速血浆反应素环状卡片试验（rapid plasma reagin test,RPR）。其原理是梅毒螺旋体可使被破坏的组织细胞释放类脂样物质，螺旋体自身释放亦产生类脂及脂蛋白。这些物质刺激机体产生抗体（IgG或IgM）。这些抗体可与从牛心中提出的心磷脂发生抗原抗体反应。由于非梅毒螺旋体感染引起的各种急性或慢性组织损伤也可产生类似的抗体，所以这种反应是非特异性的，适合用于筛选实验。下面简介RPR试验原理：将标准的心磷脂抗原吸附在特制的活性碳粒上，这种碳粒抗原与患者血清混合在一起后，可以与血清中抗心磷脂抗体起反应在白色纸卡上形成肉眼可见的黑色凝集颗粒。试剂：RPR试剂盒（试剂公司提供）方法：1）将待检血清及试剂用前放室温平衡（23-29），冻干阳性对照血清应在试剂前5分钟用0.2ml生理盐水溶解。2）吸取待检血清50l，在卡片圈内，并将血清用牙签或吸液嘴扩展到整个圆圈。3）将盒内RPR抗原悬液轻轻摇匀，用专用滴管和针头吸取抗原于每个血清圈内垂直加一滴。4）振荡或摇动8分钟后，立即在明亮光线下用肉眼观察结果。5）如有需要，阳性标本可做1:2 1:4 1:8 1:16和1:32稀释，按定性试验方法作定量试验。结果判定：阳性反应：中等或大块黑色凝集块。弱阳性反应：散在的小黑色凝集块。阴性反应：黑色均匀分散无凝集块。必要时应再做TPHA试验确证。注意事项：1、本试剂应保存于2-8，效期一年。2、如做半定量试验，可将待检血清用生理盐水作倍比稀释，然后按上述方法进行试验，以呈现出明显凝集反应的最高稀释度作为该血清的凝集效价。3、本试验系非特异性反应，需再做TPHA确证。二期梅毒时，如出现弱反应和可疑反应，应将血清稀释，以排除“前带现象”。五、TPHA梅毒螺旋体血凝试验试验原理：试验血球为用螺旋体特异性抗原包被经过醛化和鞣化的鸡红细胞，对照血球为没有用上述抗原包被的经过醛化和鞣化的鸡红细胞，如果是阳性标本，当和致敏的鸡红细胞混合后，抗体和抗原的结合会引起致敏血球的凝集，在血凝板底部形成凝集块，如为阴性标本 ，则血细胞在孔底形成致密的沉淀。操作方法：1. 在反应板的第一排：每孔加25ul（1滴）稀释液2. 在反应板的第二排：每孔加100ul（4滴）稀释液3. 在反应板的第三排和第四排：每孔加25ul（1滴）稀释液。