实验报告三 免疫印迹.doc

实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液 Tris 3.025g 甘氨酸 14.413g 甲醇 20mL 加蒸馏水约800mL，调pH至 8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS) Tris 2.42g NaCl 27.750g 加蒸馏水约800mL，调pH至 7.5，定容1000mL2.1.3 TTBS TBS 800mL Tween-20 400l2.1.4 封闭液及抗体稀释液 脱脂奶粉 0.3g TBS 100mL2.1.5 底物溶液 二氨基联苯胺（DAB） 5.0mg TBS 18mL H2O2 20l 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液 丽春红 1g 4%乙酸 100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水 小牛血清 7.5mL 0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500） 酶标抗IgG 0.1mL 5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器 夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。不同之处如下：3.1.1 样品制备：取人血清0.1ml，加稀释5倍的上样缓冲液0.5ml，振摇后10000rp/5min离心，取80l上清液加入等体积的样品缓冲液，在沸水浴中加热3min。瞬间离心，取上清液上样。3.1.2 加样：拔出梳子，用电极缓冲液冲洗样品槽后加样。上样量从左到右为5、20、15、10、5、5、5、5、10、15、20、5l（从中间分开，两侧对称）。3.1.3 电泳：稳流10mA电泳，当溴酚蓝指示剂前沿到达距底部1cm左右时，停止电泳。取出胶，将点有样品的胶条从中间切成两条，一条用常规方法染色和脱色，另一条用于转移和酶联。3.2 转移蛋白质到硝酸纤维素膜上（电转移）3.2.1 切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液浸泡5min使没有气泡。3.2.2 剪2张滤纸与胶尺寸大小相符，将其与海绵一起浸泡在转移缓冲液中。3.2.3 打开转移槽的胶板，依次放入：a. 一张浸湿的海绵；b. 一张用转移缓冲液饱和的滤纸；c. 用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心的赶走滤纸和胶之间的气泡；d. 硝酸纤维素膜，正面对着胶，在胶和膜的右下角剪一小角，以标明方向；e. 一张用转移缓冲液饱和的滤纸；f. 一张浸湿后的海绵。3.2.4 小心的合上胶板，并立即放入转移电泳槽中。加转移缓冲液至满。3.2.5 插好电极，注意正负极方向，胶侧为负，NC膜侧为正。打开电泳仪开关调至稳压60v，电泳2h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。3.3 膜的酶联免疫染色3.3.1 用丽春红溶液检验转移是否成功，若显色清楚，用蒸馏水冲洗，TBS洗膜1min。3.3.2 将膜放入培养皿中。加封闭液后在37摇床上摇动60min。3.3.3 取出膜，用TTBS洗膜3次，每次3min，将膜放入另一个培养皿中。3.3.4 在培养皿中加入用150ml 5小牛血清生理盐水配制的1：1500的酶标IgG，在冰箱中振荡过夜。3.3.5 取出膜，用TTBS洗3次，每次3min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。3.3.6 将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，取出膜，将胶制成干板。4 实验结果 4.1 SDS-PAGE电泳分离结果（图1右）上样量为10l的泳道分离效果较5l的泳道好，共出现4个较清晰的条带。4.2 显色后的免疫印迹膜（图1左）在免疫印迹膜上共检测出一条带C1，应该为球蛋白，对应于右图中的C。CC1人血清蛋白 10 5/l图1：SDS-PAGE电泳分离结果（右图）和显色后的免疫印迹膜（左图），图上所标的数字分别为每一个泳道的上样量（单位/l）5 讨论5.1 本实验所用的样品是人血清，人血清的成分非常复杂，BioPharm International （2003）报道：Melecular and Cellular Proteomics 2002年12月号发表的一篇论文称，人血清中已确证的蛋白种类几乎翻了一番，即达到490种。这是Pacific Northwest National Laboratory（PNNL）的科学家利用液相层析法和质谱分析法代替传统凝胶电泳法鉴定的成果。这些人血清蛋白包括了先前在血清中未鉴定出来的低丰度蛋白，以及尚未明功能的蛋白。由于方法的限制，我们所用的传统电泳方法根本不可能完全分离。5.2 血清中的蛋白主要是由白蛋白与球蛋白所构成。健康人的白蛋白与球蛋白的比例为白蛋白约67，球蛋白约33% 。所以图1右中条带较深的蛋白质（C）应该为球蛋白，图1左中被检测的条带（C1）恰好是这条较深的条带，说明被检测的蛋白就是免疫球蛋白G（IgG）。这样图1左的免疫反应结果也得到合理的解释，但是决定性的结论应从两种蛋白在SDS-PAGE电泳中的迁移率进行分析，但是尚未得到此方面的资料。5.3 本实验所用的免疫印迹方法称酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），其方法简单，方便迅速，特异性强。ELISA是由抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。并且抗原与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时，才出现可见反应。5.4 IgG即免疫球蛋白G，与IgM和IgA属三种同种型天然自身抗体。酶标记抗体IgG是将酶与抗IgG抗体经适当方法连接而成。由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。本实验所用的供氢体DAB(3.3二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑