western实验步骤与注意事项.doc

葵花宝典致亲爱的师弟师妹：本着不希望你们来到实验面临一些束手无策的窘境，师姐在这里把自己所学和资源略写一二。1、 来到实验室，无论你喜欢不喜欢，乐不乐意，一定要把实验室的师兄师姐的名字都记住，以及实验室里有什么仪器！2、 关于实验部分1、 组织蛋白提取：方法一：（1）4下，先生理盐水洗，再加入蛋白提取液，剪刀剪碎，匀质器6000，循环六次，每次都拿下来冰镇，防止蛋白变性，最后14000转，20min，4（2） 跑western之前，需测BCA，以保证每个组分上样的蛋白总质量一样（此处为定量实验，看目标蛋白的表达量，若仅仅定性则无需做BCA）注意事项：匀质器需要用的小管和玻璃球在郝荣华师姐那里，先加玻璃球一般，目测大概三四毫米高度就行（包括管底小尖尖），且溶液必须装满才振荡效果好，因此，加入细胞裂解液多，容易导致蛋白浓度低。方法二：（1） 取冰（东边实验室，最后面有制冰机）（2） 将软骨从80冰箱取出，置于冰面上解冻（3） 去细胞室的液氮罐里，取出少量液氮置于泡沫箱内，（4） 转移至实验室内，取出少量，倒入研钵中，研磨（5） 浆糊状，立即转入EP管中，（6）细胞裂解液，2、western blotting（1）抗体购买1. Antigen,也就是抗原名称,最好是英文全称,许多客户只说简称,要知道不同的抗体其简称有可能会一样的.有中文最好也提供一下. 2. Reactivity,即反应性,也就是实验用于什么特种,是人,大鼠还是小鼠等3. Host,宿主,就是抗体来源,这个主要和二抗有关系。一抗来源必须要和二抗搭配,且不能和样本来源相同。比如,二抗是羊抗小鼠,一抗就要选择小鼠来源的.不少客户常常是先有二抗,再买一抗,受限制得很,其实应该先订一抗,再买二抗,毕竟一抗贵,为了将就一个100元左右的二抗,而把几千元的一抗的订购弄得很复杂,真是不划算.所以,不要为了二抗伤脑筋4. Conjugate,即缀合物或标记物,如是不是需要FITC标记,HRP标记等情况,也最好说明5. Applications,就是应用. 你买这个抗体用于做什么实验,是IHC还是WB,这点一定要说,要知道,抗体开发出来,不是什么实验都能用或都会效果好,抗体公司说明上写着能做的实验是经过验证的,没有写的不是说一定不能做,也可能可以做,但没有验证,厂家不会乱说的,也是科学，负责的态度.例如,你要是想做IHC-P,就是石蜡切处的免疫组化,如果买不到抗体明确说可以做,你要用就得冒风险,好在现在抗体厂家众多一般都找得到了（2）-actin（内参蛋白） 分子质量为43KD，因此，目标蛋白不能和内参蛋白分子质量一致，内参也叫看家基因，在组织或细胞中都会表达，且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的，一般有-ACTIN，GAPDH等。其作用有二：（1）、 是看提取蛋白质量的好坏。如果做western的时候，内参照蛋白有条带，而目的蛋白没有，说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题，是目标蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。（2）、是比较客观的说明目标蛋白的表达情况，消除上样量等的误差。不同的标本之间由于蛋白提取的量有差别，可能强阳性的表达跑出来的带很弱。因此设立内参照，比较不同标本之间的表达情况。因此， 最好测一下蛋白浓度再上样，这样好点。当然也看你的实验室是定性还是定量了，定性的话，我觉得可以不用测浓度；要是准备定量，还是尽量保证上样量一致吧。 （3）5倍的上样缓冲液：用样品稀释上样缓冲液至1倍，煮沸5min，离心2min（使粘壁蛋白脱落至底部），可以放于-20隔夜保存（4）清洗工具：玻璃板，盖玻片，大烧杯和小烧杯，梳子，铸造支架，（5）根据试剂盒配分离胶。AP（10%过硫酸铵）和TEMED最后加，先混匀之前的溶液（6）沿着玻璃槽边，注胶，不要有气泡，用水封胶，30min（7）配浓缩胶，同（5）SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 （8）倒掉水，用滤纸片吸干，注胶，插上梳子，避免有气泡，30min（9）安装至电泳槽，拔下梳子，加入电泳缓冲液（需要自己配，可查百度知道配方），没过玻璃板（10）上样 1.5 mm 上样量最多可为35微升，0.75mm 上样量最多为20微升红色为正极，黑色为负极。80v 30min， 上样线压平后，120V 2h1.5h 或 200V 1h电泳缓冲液配方：（11）拆开电泳槽，将凝胶放在ph=9.15缓冲溶液。（12）裁剪略大于凝胶的滤纸片六张，两张滤纸片置于PH=9.15缓冲溶液中，其余放于ph=5.19缓冲溶液中。（13）裁剪PVDF膜一张，置于甲醇溶液1min（活化PVDF，使膜表面带正电荷），再置于蒸馏水2min，摇床一会，再置于PH=9.15缓冲溶液中（14）转膜：先铺两张滤纸（ph=9.15），再铺凝胶（靠近负极），再铺PVDF膜（靠近正极），再铺四张滤纸（ph=5.19），记得润湿电转仪的上下面板Buffer 1（PH=9.4）配方：Tris 3.03g 甘氨酸 5.25g 甲醇 200ml 去离子水 1L（15）膜的面积*4.5=转膜电压，40min 200mA，20min？ 100mA 目标蛋白多大，就多久转膜效果不太好，时间不够（16）最好用TBST清洗转膜液，再用5%脱脂牛奶（ 5g脱脂牛奶粉末，100ml PBST （500ml 1*PBS + 1ml Tween-20，调pH 7.0-7.2，即为PBST） ）中浸泡PVDF膜，1小时10*TBS tris 12.1g NaCl 88g 去离子水 1L 浓盐酸调PH至8.0如果配置1000ml的TBST： 先称量NaCl 40g ，倒入烧杯中，加DDW蒸馏水400ml,再称量NaCl 47.6g，倒入刚才的那个烧杯中,：由于NaCl的量太多，一次称量不方便，所以分两次称量，且易于溶解）。往烧杯中加入TrisHCl缓冲液100ml，最后加吐温20， 5ml,转入1000ml容量瓶中，在定容，转移即可。 （17）加一抗（5%脱脂牛奶稀释）孵育过夜，4（18）PBST洗三次，每次5min（19）加二抗（5%脱脂牛奶稀释）摇床，室温孵育，一小时（夏天半个小时）（20）PBST洗四次，每次5min（20）显色（全称避光操作）：配制ECL溶液， 1.5ml左右（一张PVDF膜），显色2min（21）凝胶成像仪分析2、 细胞蛋白：可直接加入蛋白提取液，浸泡30min3、 固绿-番红O染色：固绿染色剂极易上色，20s 即可，无论你购买的哪个牌子。番红O染色剂极难上色，染色时间为25min（索莱宝），效果仍不太理想。番红O染色剂，两个小时，不理想（染色过程中，切勿放在通风橱中，染色剂会变干）4、匀