分子生物学论文.doc

基因工程改良在昆虫病原真菌中的应用研究进展摘要 昆虫病原真菌是自然界控制害虫种群的主要生物因子，其研究开发越来越受到重视。但由于存在致死速度慢、防效不稳定、对环境条件要求高等缺点，限制了昆虫病原真菌的应用。近年来，通过基因工程技术对昆虫病原真菌进行遗传改造，提高菌株的致病性和毒力，创造高效、稳定的工程菌株取得了较大进展。对昆虫病原真菌选择标记、遗传转化方法、基因工程改良及应用等方面最新研究进展进行了综述。关键词 昆虫病原真菌 基因工程 转化方法 菌株改良 研究进展目前已知昆虫病原真菌（）多种，能以多种昆虫为寄主，是自然界中控制昆虫种群的主要生物因子。在人工释放条件下，可有效控制目标昆虫种群数量。昆虫病原真菌具有主动致病性、较强的扩散能力、较长的土壤宿存能力、以及寄主不易产生抗性等特点，可在害虫种群中形成疾病的传播和流行，实现对害虫种群的持续控制。其兼性寄生的营养方式，体壁及消化道入侵方式和孢子宿存机制在害虫的综合治理中表现出强大的生命力，其研究开发也越来越受到国内外的重视。但昆虫病原真菌也存在致死速度慢、防效不稳定和易受环境因素影响等不足，这在一定程度上阻碍了真菌杀虫剂的应用。近年来，昆虫病原真菌致病机理和分子生物学方面的研究有了较快的进展。相关研究主要集中在利用基因工程手段对昆虫病原真菌进行改造，提高菌株的杀虫毒力、杀虫速度以及抗逆能力等方面。本文主要介绍近年来有关昆虫病原真菌遗传转化和基因工程改良方面的进展和前景。选择性标记在基因工程中，重组子的筛选通常需要基因标记。基因标记是指将具有标记功能的外源引入受体菌株，从而使受体菌株细胞能够在环境中与其他微生物相区别的一种标记方法。被引入的一般以质粒的形态存在于受体细胞中，或整合到受体细胞的染色体中并稳定遗传。有效的选择性标记可降低假阳性、减少工作量，因此，合适的选择性标记是成功转化的前提。目前用于昆虫病原真菌基因工程改良的选择标记主要有营养缺陷型标记、抗性标记和报告基因标记三大类。营养缺陷型标记营养缺陷型标记是一种常用的选择性标记，通过转入的标记基因与受体细胞突变基因互补，从而使受体细胞表现野生型生长。营养缺陷型标记在昆虫病原真菌遗传转化中应用的较少。等用氯酸盐抗性筛选出了白僵菌（）、绿僵菌（）的硝酸盐还原酶缺失突变株，然后用构巢曲霉的基因转化突变菌株获得成功。另外，等在进行农杆菌介导的绿僵菌转化中，获得了色氨酸（）缺失突变体，并证明其可以作为一种选择标记；同时指出其它合成代谢基因和也可作为绿僵菌营养缺陷型标记。由于使用营养缺陷型标记要求有特定营养缺陷型受体菌，而在大多数昆虫病原真菌中难以获得适宜的营养缺陷型菌株，所以限制了这一选择性标记的应用。抗性标记抗性标记是指将抗性基因转入受体菌中，转入的基因可以使受体菌在一定药物浓度下生长而表现抗药性。目前用于昆虫病原真菌基因工程中的抗性标记基因主要有抗杀菌剂和抗除草剂基因两大类。抗杀菌剂基因有潮霉素抗性基因（）和苯菌灵抗性基因（粗糙脉孢霉基因）。近年来，潮霉素抗性基因被用于球孢白僵菌和玫烟色拟青霉（）的抗性标记；苯菌灵抗性基因除上述两种真菌外，还被用作绿僵菌和淡紫拟青霉（）的抗性标记。用作真菌标记的抗除草剂基因主要是草丁膦抗性基因，目前已经被用于球孢白僵菌、玫烟色拟青霉和金龟子绿僵菌的遗传转化。报告基因标记为了更加精确和灵活的筛选转化子，最近几年利用报告基因标记进行真菌转化子的筛选逐步得到广泛应用，而且大都是采用报告基因与抗性基因相结合的方法。目前应用的报告基因主要是绿色荧光蛋白基因。绿色荧光蛋白基因作为一种新型、方便的报告基因，在基因表达调控、迁移变化、转基因研究等诸多方便显示了良好的应用前景。如等构建带有绿色荧光蛋白标记基因和苯菌灵抗性标记基因的双元载体，并将其转入绿僵菌中。应盛华构建了含有绿色荧光蛋白基因和草丁膦抗性基因的双元质粒，并成功导入球孢白僵菌中。两种标记方法相结合为筛选和检测工程菌株提供了一个非常有效的工具。遗传转化方法昆虫病原真菌基因工程改良首先取决于高效转化体系的建立。自年等首次报道粗糙链孢霉（）的转化以来，真菌的遗传转化研究取得了很大的进展。目前，用于昆虫病原真菌转化的方法主要有以下几种方法。原生质体（）转化法原生质体转化法是通过在培养物中加入等多聚物，使细胞膜之间或与膜之间形成分子桥，促使细胞间接触和粘连，或是通过引起表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞间的融合或外源的进入。与类似的多聚物还有多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等，这些多聚物和二价阳离子（、）以及外源在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吸作用而进入细胞体内。近年来，转化法在病原真菌的遗传转化中得到广泛应用。等通过转化法，将带有苯菌灵抗性的质粒导入金龟子绿僵菌，转化率为个转化子。等同样利用介导转化法将质粒导入玫烟色拟青霉和淡紫拟青霉中。等采用介导法，成功的进行了白僵菌的遗传转化，线性和圆形的质粒的转化率分别为和个转化子。原生质体转化法以原生质体作为受体细胞，具有群体数量大、容易获得纯合性的转化子等优点，但原生质体具有周期长和再生频率较低等缺点，造成此方法操作繁琐、转化效率很低。电激转化法（）电激转化法是以原生质体或者完整的细胞为受体的转化方法。其原理是利用短暂的电场脉冲作用，使原生质体膜或细胞膜形成可逆的瞬间通道，从而使外源摄入，然后利用质膜在一定时间内所具有的自动修复能力，使细胞恢复到正常的生理状态。目前电激转化已经应用于不同物种的完整细胞和原生质体，包括昆虫病原真菌、细菌以及哺乳动物等。如等将带有和双标记基因的质粒采用电激法转入到白僵菌中，转化率高达个转化子，转化子有丝分裂稳定性高达。与原生质体转化法相比，电激转化方法虽然简化了操作步骤，但对提高转化率并无明显作用。基因枪转化法（）基因枪法是世纪年代末发展起来的，由美国大学生物化学系等于年研究成功。其原理是在基因枪激发的瞬间力量作用下，将外源基因直接导入受体细胞中。目前该法已成功地应用于真菌、细菌、高等植物等。等利用基因枪法分别转化昆虫病原真菌玫烟色拟青霉的原生质体和未分化的分生孢子，发现原生质体的转化率为每微克质粒个转化子，而分生孢子的转化率则为每微克质粒个转化子。等采用基因枪法将质粒导入到绿僵菌中，平均转化率可达到个转化子。基因枪法的突出优点是操作迅速、简单以及受体材料广泛。不足之处就是价格昂贵、嵌合体不易排除不易选择转化体、转化频率低以及转化受体细胞再生困难等。限制性内切酶介导转化法（，）限制酶内切介导转化法是转化的一项新技术，其原理是在限制酶存在下，用质粒转化真菌，外源基因可以插在基因组的相应酶切位点，而使外源基因整合到受体菌染色体上，从而获得转化子。该方法首先在酵母菌（）中由和建立，它使转化率比直接转化提高了倍，目前该转化技术己应用于许多真菌的转化。等利用介导法转化了昆虫病原真菌玫烟色拟青霉，供试的三个质粒，和的转化率分别是每微克，和个转化子；在优化条件下，前两个质粒的转化率分别达到每微克和个转化子，其中的最高转化率为每微克个转化子。等采用优化的限制酶内切介导转化法转化白僵菌芽生孢子，转化率高达个转化子。插入突变技术操作简单，转化效率高，单拷贝插入概率大，转化程序与一般真菌转化相似，对大多数已实现转化的真菌均实用。农杆菌介导转化法（ ，）根癌农杆菌（）是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，在自然条件下它可通过伤口进入植物细胞，并将其序列转入植物细胞并整合到基因组上。在此启发下，年，等首次成功进行了根癌农杆菌介导酵母菌的遗传转化。三年后，等利用成功转化了，等六种丝状真菌，并证明异源的根癌农杆菌可以单拷贝地随机插入到丝状真菌染色体中。该方法现在已经广泛应用于真菌转化中。根据等的统计，目前通过该方法实现转化的丝状真菌已有余种，包括在昆虫病原真菌转化中的成功应用。方卫国等建立了农杆菌介导的球孢白僵菌遗传转化体系，成功的利用农杆菌介导将构建的双元载体转入到球孢白僵菌中，转化效率为个转化子 孢子。等采用农杆菌强株系将质粒转入不同浓度的昆虫病原真菌玫烟色拟青霉分生孢子中，转化率分别为 个转化子 孢子， 个转化子孢子和（）个转化子孢子。该方法具有操作简便、转化效率高和转化子稳定性好等优点，是一种很有前途的真菌转化方法。但根瘤农杆菌介导的转化易发生异源重组，很难用于基因敲除和替换，此外还需外源基因受体与农杆菌共培养，费时较多；且转化效率与农杆菌菌株种类、共培养的时间有关。因此，昆虫病原真菌的遗传操作需要一套更加实用、高效和稳定的遗传转化体系。昆虫病原真菌的基因工程改良相关的基因被逐步克隆，为菌株的改良奠定了良好的基础。目前昆虫病原真菌改造的目的主要包括提高对目标昆虫的毒力和杀虫速度、扩大菌株应用范围以及改变菌株寄主范围等几个方面。提高昆虫病原真菌杀虫毒力和杀虫速度昆虫病原真菌往往存在杀虫速度较慢的问题，因此如何通过基因工程的手段来提高其毒力、缩短致死时间是人们面临的一个重要课题。目前提高杀虫速度的手段主要包括加快孢子萌发和侵染速度来缩短菌株寄生时间；高效表达在穿透昆虫体壁时起重要作用的水解酶，提高病原真菌穿透昆虫体壁的速度；高效表达削弱寄主免疫能力的基因，如提高毒素的水平可缩短击倒寄主所需时间；以及高效表达与能量代谢相关的基因，加快吸收能量物质的速度，破坏寄主的正常生理活动。等将昆虫病原真菌金龟子绿僵菌的蛋白酶基因插入到原有的绿僵菌基因组中，过量表达的蛋白酶使菌株毒力大大提高，使染病烟草天蛾的取食量下降，虫体死亡时间缩短。等通过遗传转化技术得到了几丁质酶超量表达的球孢白僵菌转基因菌株，研究发现转化菌株对蚜虫的致死浓度和致死时间都降低了，明显改善和提高了白僵菌的生防活性。外源基因的转导为昆虫病原真菌的抗性选育及超级菌株的构建提供了良好途径。扩大昆虫病原真菌的应用范围许多昆虫病原真菌不能与其他杀虫和杀菌剂同时施用，并且对田间环境有一定适应性要求，这就对昆虫病原真菌的应用提出了一定的挑战。利用基因工程技术对昆虫病原真菌进行遗传改造，提高菌株的抗逆力（如抗杀菌剂、抗除草剂、耐旱、耐暑等），可以在一定程度上达到扩大昆虫病原真菌的应用范围的目的。等将构巢曲霉的苯菌灵抗性基因，通过质粒导入金龟子绿僵菌中，获得了既对烟草天蛾（）具浸染活力，又对杀真菌剂具有抗性的工程菌株，从而为绿僵菌与杀菌剂混合使用提供了可能。应盛华从球孢白僵菌中克隆了一个与孢子耐热相关的蛋白基因，证明了它对孢子耐热力的功能及贡献，并成功地用于构建具有抗逆功能的重组菌株，使重组菌株的耐热力得到显著提高。目前，基因工程改良生防菌株的工作主要集中在增强毒力方面，而增强菌株抗逆力的工作却明显落后。随着杀虫真菌制剂应用不断扩大，对菌剂抗逆特性的要求更高和多样化，利用遗传转化手段增强菌株抗逆生物学特性将有很大的发展空间。改变病原真菌的寄主范围从种的角度考虑，昆虫病原真菌的寄主范围较广；而从菌株的角度考虑，各个菌株具有一定的寄主专一性。但在田间，经常是多种害虫同时危害一种作物，所以昆虫病原真菌的这种寄主专一性在一定程度上影响了它们的应用。因此，有必要适当提高具有寄主专一性的真菌杀虫剂的寄主范围。决定昆虫病原真菌的寄主专一性的生物化学和分子生物学过程非常复杂，有关昆虫病原真菌寄主专一性的分子生物学和生物化学研究要落后得多，目前还停留在生理学研究和一些现象描述的水平。因此，为了利用基因工程技术改良昆虫病原真菌的寄主范围，应加强病原真菌与昆虫之间相互作用的分子生物学研究，从而揭示与寄主专一性相关基因。展望随着昆虫病原真菌的遗传学和分子生物学研究的逐步深入，大量与毒力、抗逆性相关的基因逐渐被克隆，病原真菌的致病分子机制将逐步被揭示。在此基础上，通过分子生物学手段构建高毒力、杀虫谱广、抗逆性强的菌株将成为未来研究的重点。同时随着人们环保意识的增强，微生物农药的应用面积在逐年扩大。改造后的昆虫病原真菌作为一类杀虫、抗逆功能更好的杀虫微生物，其应用范围也将呈现逐年增加的趋势，具有非常广阔的应用前景。此外，改良昆虫病原真菌、创造高效杀虫微生物，对于高效、安全、可持续的控制有害生物，在理论和应用上均具有非常重要的意义。参考文献， ，（）：2 ， ， ， ，（）：3 ， ， ，：4，（）：5 ， ， ， ，（）：6 ， ， ， ，：7，（）：8，（）： ，：9 ， ， ，：0， （ ） ，（）：1，（）：12，（）：13，（）：14，（）：15，：16，（）：17，18，（）：19，：，：，：，20迟彦，周东坡根癌农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用菌物学报，（）：21黄亚丽，叶婧，蒋细良，等真菌遗传转化系