酵母的分子生物学鉴定.pdf

技 术 与 方 法 生物技 术通报 BI oTECHNoLOGY BULLET I N 2 o o 8年 第 5期 酵母的分子生物学鉴定 唐 玲 刘 平 黄 瑛 杨 江科 闫 云君 华中科技大学生命科学与技术学院 分子生物物理教育部重点实验室 武汉 4 3 0 0 7 4 摘要 酵母种类繁多 与人类的关系极其密切 但 目前由于研究方法的不同 对于酵母的分类还存在着不同的分 类体 系 而准确快速的对酵母进行鉴定 既可以有效防止食品腐化变质 又可以增加经济效益 同时也为酵母的分类鉴定 奠定一定的理论基础 对常用的核糖体 DN A鉴定法 D NA指纹图谱鉴定 脉冲场电泳鉴定 实时 P C R 和基因芯片等分 子生物学鉴定方法在酵母鉴定工作 中的研 究情况进行了比较 关键词 核糖体 DN A DN A指纹图谱脉 冲场凝胶 电泳实时 P C R基因芯片 M o l e c u l a r Bi o l o g y I d e nt i fic a t i o n f o r Ye a s t Ta n g L i n g L i u P i n g Hu a n g Yi n g Ya n g J i a n g k e Ya h Yu n j u n K e y L a b o r a t o r y o f Mo l e c u l a r B i o p h y s ic s H u a z h o n g U n i v e r s i t y of S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y W u h a n 4 3 0 0 7 4 Ab s t r a c t Ye a s t s h a ve wi d e r a n g e a nd a r e i mpo r t ant t o hu ma n b e i n g s The r e e x i s t s o me c l a s s i fi c a ti o n s y s t e ms o f y e a s t s b a s e d o n r e s e a r c h me t hod s I t i s n e c e s s a r y t o fi nd a n a c c u r a t e a n d e ffic i e nt me t h o d t o i d e nt i f y y e a s t s t hu s be i n g a b l e t o p r e v e nt f o o d c or r u pti on a nd i nc r e a s e e c o no mi c e ffic i e nc y Als o i nf o r ma t i o n a b ou t the c l a s s i fic a ti o n c o u l d be p r o v i de d Thi s p a pe r de s c ribe d mo l e c u l a r i d e n t i fic a tio n me thods f o r y e a s t i nc l ud i n g ribo s o ma l DNA DNA fin g e r p r i nt i n g p u l s e d fi e l d g e l e l e c t r o p ho r e s i s r e a l t i me PCR a n d g e ne c h i ps Ke y wo r d s Ri b o s o ma l DNA DNA fi n g e r p ri n t i n g P u l s e fi e l d g e l e l e c t r o p h o r e s i s Re al t i me P CR Ge n e c h i p s 酵 母 种类 繁 多 不仅 作 为 一种 重 要 的工 业微 生 物被 广 泛 应 刖 于 各 个 领 域 近年 来 人 们 还 利 用 酵 母发酵来生产抗生素 维生素和酶等高附加值的产 品 但 酵母 也会 引发 食 物 制造 物 的腐 坏 变质 从 而 给人 们 带来 巨大 的经济 损 失 有 的酵 母 还是 人 体 和 动物 的致 病 菌 如 C a n d i d a a l b i c a n s 近 两个 世 纪 以来 酵母 菌分 类 主要依 据 形 态学 鉴 定 和生 理 生 化 特 性 目前 已发展 起来 各 种 用 于酵 母 快速 检 测 的 商 业 化 的试 剂 盒 可 实 现部 分 酵 母 多 是 针 对 导致 疾 病 的部 分 致 病 酵 母 的 鉴定 但 是 该 类 试 剂 盒 对 酵母的检测不仅费时 而且鉴定结果准确性不高 由于受 到环 境 因素 的 影 响 某 些 酵 母 菌 属 种 在 形 态学 及生 理生 化 特性 方 面差 异 极不 显 著 在 这 样 的 背景 下 以化 学 为基 础 的分 类 法 建 立 起 来 通 过 细 胞壁 的成份 生物合成以及 同功酶 电泳图谱分析来 对 酵 母进 行 分类 鉴 定 现在 随着 分 子生 物 学 的发 展 D N A D N A杂交 染色体组型分析 e l e e t r o p h o r e t i c k a r y o t y p i n g 染 色 体 D N A的 限制 性 片段 长 度 的 多 态性 分 析 R e s t r i c t i o n F r a g me n t L e n g t h P o l y m o r p h i s m a o f c h r o m o s o ma l D N A 线 粒 体 D N A m i t o c h o n d r i a l D N A 及 核 糖 体 D N A 序 列 分 析f r i b o s o m a l D N A s e q u e n c i n g 实 时 P C R r e a 1 t i m e P C R 基 因 芯 片 g e n e c h i p s 等 分 子 生物 学 的方 法广 泛 地应 用 于 酵 母 的鉴定 中 分 子 生 物学 的方 法 不仅 能 够快 速 的将 各 种 酵母 鉴 定 到属 或 种 而 且 鉴定 的结 果精 确 度更 高 随着 数 据 库 中分 子 信息 量 的增 加 近年 来 应 用 分子 生 物学 技 术鉴 定 酵母 菌 种 的研 究越 来越 广 泛 1 核糖体 D N A鉴定法 核 糖 体 D N A 普遍 存 在 于 生 物 中 真 核 生 物 的 核 糖体 R N A 中包括 2 6 S 1 8 S 5 8 S和 5 S 4种不 同 收稿 日期 2 0 0 8 0 3 1 4 基金项 目 国家高技术研究发展计划 8 6 3 项 目基金 2 0 0 3 A A 2 1 4 0 6 1 2 0 0 6 A A 0 2 0 2 0 3 作者简介 唐玲 1 9 8 3 一 女 硕士研究生 研究方 向 分子生物学 E ma i l t a n g l i n g l 0 1 4 9 9 1 6 3 e o m 通 汛作者 闫云君 1 9 6 9 一 男 教授 博 士生导师 E ma i l y a n y u n j u n t o m c 0 m T e l O 2 7 8 7 7 9 2 2 l 4 维普资讯 2 o 0 8 年第 5期 唐玲 等 酵母 的分子生物学鉴定 沉降系数的核糖体 R N A片段 它们分别对应 的基 因片段既具有遗传上 的相对稳定性 同时由于各种 原 因具有一定的突变 使 它们作为一种 良好 的生物 分类鉴定材料得到广泛的重视 早期一般选取 大小 适 中的 1 8 S序列作为鉴定的标 准 随后 2 6 S的 D 1 D 2区序 列 和 I T S序列 也 被 用 于应 用 于鉴 定 工 作 中 图 1 8S 5 8 S 26 S 5 S 一 J u L 一 0 L 0 IT S 1 I T S 2 IGS I I G S 2 图 1 真核生物中编码核糖体的序列 5 3 1 1 2 6 S r DNA 的 D1 D2序 列 2 6 S r D N A 5 末 端 有 一 个 长 约 6 0 0 b p的 D 1 D 2 序列 根 据 P e t e r c o n f 对 核 苷 酸 序 列 可 变 区 D 2的 多 态性分析 发现这一 区域在 同种 间的该区域 核苷 酸 的差 异 小 于 1 而不 同种 之 间 的差 异 通 常 远远 大 于 这 个 数 据 这 一 试 验 结 果 表 明 可 以 利 用 2 6 S r D N A 的 D 2区域 进行 引物设 计 NL l 5 一 G C A T A T C A AT A AGC GGAG GAA AAG一 3 和 NI A 5 GGT C C GT G rI 耵 C A A G 3 扩 增 2 6 S r D N A D 2区基 因 片 段 根 据 同源性 序 列来 对 待 测 酵母 进 行分 类 该方 法 已经 作 为 一种 酵 母分 类 和 鉴定 的方 法被 人 们广 泛采 用 通 过 K u r t z ma n等 2 在 子 囊 类 酵 母 2 6 S大 亚 基 的 研 究 以及 F e l l 等 l 对担子酵母和类酵母真菌 2 6 S大亚基 的研 究 基 于 2 6 S的 D 1 D 2的 酵母 鉴 定数 据 库初 步 形 成 目前 绝 大 多 数 酵 母 菌 种 模 式 菌 株 的 2 6 S r D N A大亚基序列 已被测定和公布 对于鉴定 提供 了很 大 的帮 助 因此 现在 广 泛 采 用 这种 方法 进 行 酵 母 菌 的鉴 定 但 是 K u r t z ma n与 F e l l 在 利用 该 方 法进行鉴定工作 中发现 有 的亲缘关 系很接近 的种 类仍旧没有办法进行明确的鉴定 为此 分别引入 了 D N A杂 交 和 I TS 的 方 法 对 鉴 定 工 作 中 有 分歧 或 不确定 的种类进行进一步的确证 1 2 1 8 S r DNA 基 因序 列 1 8 S r D N A作为一种经典的鉴定方式在真菌 的 鉴 定 工 作 中 占有 重 要 作 用 用 于 扩 增 1 8 S片 段 的 P C R引 物是 根 据 真菌 1 8 S的保 守 区域 设计 常用 的 引物 正 向引物 5 C C A A C C T G G r I G A r C C T G C C A G T A 3 和 反 向引 物 5 C C T r G T r A C G A C T I A C C T T C C T C T 3 通 过 P C R对 酵 母 1 8 S r D N A 片 段 特 异 性 的扩增并测序 把测 序结 果进行多态性分析 从而 将待测酵母 正确的分类 1 3 5 8 S I TS I T S 1 与 I T S 2属 于 间 隔 区 利 用 I TS 1 和 I T S 2的 保守序列设计 引物 ffS 1 5 T C C G T A G G T G A A C C T GC GG 3 I I 1 s 4 5 一 T C C T C CG C n1 A T T GA n T GC一 3 扩增 I TS 1 5 8 S I 2 r D N A序列 扩增产 物大小在 3 5 0 1 0 0 0 b p不等 通过扩增产物多态性分析对酵 母进行分类 R o s a在对 C a n d i d a s p 中的各个种的 确 定 中也 也 发 现 了这 个 缺 陷 在 将 P C R 扩 增 产 物 比对 时发 现 2 6 S r D N A D1 D 2序 列 的特异 性 没 有 5 8 S I 的效 果 好 1 4 I G S r DNA 基 因序 列 I G S r D N A处 于 转 录 间 隔 区 由 于该 区段 选 择 压力相对较小 在进化过程 中存在着 比表达序列更 为 丰 富 的变 异 序 列 差 异 较好 地 反 映 了种 属 间 的 系 统 发 育 关 系 根 据 I G S r D N A 的保 守 区 域设 计 引 物 2 6 S F 5 一 AT C C TI TGC AGAC GAC T T GA一 3 5 S R 5 一 AGC Tr G AC T T C GC AGAT C GG一 3 5 7 o C退 火 进 行 扩 增 得到大小各异的 I G S 1片段 根据片段的同源性 对酵母进行分类 利用 I G S 1 来鉴定遗传距离近得 菌株能够更加有效的将其快速便捷 的分类 其种间 分辨能力远大于 I TS 鉴定 目前 这一方法的应用 仍 旧相对较少 在对同源性 非常接近 的种属研 究 中 这 一 方 法有 很 大 的 研究 前 景 核 糖 体 D N A多 态 性 分 析 越 来 越 广 泛 的应 用 于 各种微生物的鉴定工作 中 其中 研究最为广泛的 是 2 6 S r D N A大 亚基 通过 K u r t z m a n和 F e l l 的努 力 将 子 囊 菌 和 担 子 菌 中 的大 部 分 酵 母 的 2 6 S D 1 D 2序列测定 出来进一步的确证 并在相应数据库 中公 布 了 相关 的数 据 资 料 够 迅 速 有 效 的对 未 知 的 酵母进 行快捷 的分类鉴定 但是 2 6 S r D N A D1 D 2序 列的研究 的精确性却不如 5 8 S I TS I G S方法 由于 I G S是处 于转录 间隔 区 其 遗传 的稳定 性相对 较 弱 从 而 使 其 在 种 与种 之 间 的 特 异 性 增 强 以 达 到 快速 准 确 鉴 定 的 目的 现 在 对 于 I TS 和 I G S的 信息 有待 进 一 步 的完 善 2 D N A指纹 图谱鉴定法 2 1 I TS K F LP 只利用 5 8 S I T S扩增结果对 于酵母进行鉴定 维普资讯 生物技 术通报 B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n 2 0 0 8 年第 5 期 需要 了解这段序列 的一级结构 如果用 C f o i Hi 凡 n Ha e l I I 限制 性 内切 酶 酶切 通 常 经过 3种 内切 酶 酶 切 后 的 D N A片 段 大小 显 示 出来 的电 泳结 果 的 多态 性 就 可 以将 不 同 种 属 的 酵 母 进 行 归 类 E s t e v e Z a r z o s o 利 用这 种 方法 对 包 括子 囊 菌 类 酵母 和 担子 菌 类酵 母 的 2 5个 属 中 的 1 3 2株 菌种 成 功 的 进行 了 鉴 定 并 提供 了一 个初 级 的 酵母 I T S R F L P数 据 库 除 C r a l b i d u s和 K 1 a c t i s等 少 数种 类 以外 大 多数 的酵母都可 以利用这个方法进行鉴定 但是有的种 需 要 用 特殊 的 限制 性 内切 酶 进 行 切 割 协 助鉴 定 工 作 R o s a 采 用这 个 方法 将 C a n d i d a的 1 6 3个 种 进行 了分类 鉴 定 初 步 获 得 了 I T S R F L P在 酵 母 分类 鉴 定 的应 用 的数 据库 这种 方 法对 于研 究 自然 发 酵过 程 中酵母 的有 性 无 性 世 代 及 过 程 中 的优 势 种 的研 究有 很 重要 的作用 现 在 这 一 方 法 已经 广 泛 的用 于 酵 母 的鉴 定 及 其 他 的真 菌 的鉴定 工 作 中 并 获得 了较好 的效 果 但是 由于 已公 布 的 5 8 S R F L P的序列 信息相对还 比较少 尽 管限制性 图谱可 以反 映各种 属的特异 性 但 对 于单 个 的酵 母 细胞 的快 速 鉴定 还 有 一 些 困 难 而且凡 是 可以引 起 酶切 位点 变异 的突 变均 可导 致 R F L P的产 生 从 而影响 图谱 的特 异性 进 而影 响 鉴定 的 结果 2 2 KAP D r a n d o m a mp h fi e d p o l y mo r p h i c DNA 技 术 利 用 约 1 O个碱 基 随 机组 成 的片段 作 为 引 物对 基 因组 的 D N A或 者 直 接 用 单 菌 落 进 行 P C R 扩增 根 据 基 因组 D N A 的 多 态 性 来 检 测 菌 株 间 基 因组 D N A 内核苷 酸 序 列 存 在 的微 小 变 异 利 用 这些 差 异的 大小 来对 相应 菌 种进 行 分类 鉴定 选取 合 适 的 引物是 R A P D技 术 成功 的关 键 C X 5 5 A C A C T G C 1 T C 3 和 P s T 5 C A G T i n C T G C A G 3 f 9 对 临 床 上 的 非 白色念 球 菌类 假 丝酵母 快 速 鉴 定有 很 好 的作 用 G o me s 等 1 o 1 利 用 R A P D对从 巴西 燃 料酒 精 产 品和 啤 酒 产 品 中分 离 到 1 0种 具有 代 表 性 的酵母 菌 株 进 行 了研 究 利用 OP B一 0 2 T G AT C C C T GG O P B一 1 0 C T G C T GGG A C O P B 儿 G T AGA CC C G T O P B 1 2 C C T T GAC G CA OP B 一 1 3 T r C CC C C GC T 0P B 1 7 A G G G A A C G A G 和 0 P B 一 2 0 G G A C C C rr r A C 作 为 引 物 扩 增 对 酿 酒 工 业 酵 母 种 类 进 行 鉴 定 R A P D和 K T S K i l l e r t o x i n s e n s i t i v i t y 技 术 联 用 在 对 亲 缘 关 系 较 近 的酿酒 酵 母进 行分 类 研究 有很 重 要 的 作用 C o n s u e l o等 l 2 J 用 R A P D技 术 对 致 病 性 C a n d i d a s p p 进 行 了快 速 有效 的检测 目前 这 种 方法 常 用 于酿 酒 工 业 酵母 以及 临 床早 期 的感 染 源 的检 测 2 3 基 于 DNA 重 组探 针 的指 纹 图谱 利 用 重 复性 的微 卫 星 D N A作 为 单 一 探针 进 行 P C R反 应 扩 增 产 物 形 成 特 异 的 指纹 图谱 通 过 指 纹 图谱的特异性来鉴定酵母 这种方法所得到的反 应 产 物 较 之普 通 的探 测 菌 种 D N A多 态 性 的方 法 具 有 更 丰 富 的多态 性 检 测 容易 重 复 性较 好 适 合 于 进 行 自动化 分析 可 以用 于这 种 方法 的重 组 序列 包 括 G T G 5 G A C A 4 M1 3 核 心 序 列 G A G G G T G G X G G X T C T 1 C A 8 C T 8等 Wi e l a n d t J 利 用 此 法 勒 获 得 C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s的 指 纹 图谱 该 方法 适 合 于数 量 少 退 化严 重 的流行 病 相 关微 生 物 的分 类 研 究 3 其它 3 1 脉 冲 电场凝 胶 电 泳 p u l s e d fi e l d g e l e l e c t r o p h o r e s i s P F GE 鉴 定 法 依 靠 有 规 律 地 改 变 电 场 的 方 向 而 使 大 分 子 D N A得 以分 离 目前 已 能分 辨 出高 达 6 0 0 0 k b乃 至 1 0 O 0 0 k b以上 的 D N A片段 1 染 色 体 条数 及 其 大小 代 表 了一 个 生 物 所 含 有 的 遗 传 物 质 的 多少 及 其 组 织形 态 的特 征 随物 种 的 分化 而 改 变 因而 具有 特 定 的 系统 分类 学 意 义 遗传 学 上 的连 锁 群分 析技 术 曾被 用来 研究 一 些有 性 型 真 菌 包 括一 些 酵母 菌 的染 色 体条 数 白逢 彦 1 6 利 用这 个方 法 对 利用 形态 和生 理 生 化 形 状 没 有 办 法 鉴 定 的部 分 疑难 酿酒 酵 母菌 株进 行 了脉 冲 电泳核 型 比较 分析 发 现这 些 菌 株 的 电泳核 型 有 明显 的不 同 但 P F G E不 能应 用 于 无性 型 真 菌或难 以进 行有 性 生殖 的种类 染 色体 组 成 多 态性 的存 在 虽 然 使 脉 冲 电泳 核 型 分 析 在 种 内 菌株 间遗传 差 异 的显 示 上具 有 一 定价 值 但却 影 响 了 其 作 为 种 问 鉴 别 特 征 的 直 观 性 而 且 无 论 是 R A P D还 是 核 糖 体 D N A都 比核 型 图谱 的 分 辨 能 力 要高 3 2 买 时 PCR 实 时 P C R是 近 l 0年 发 展起 来 的技 术 通 过 在 P C R反应体系中加入荧光基团 利用荧光信 号积累 维普资讯 2 0 0 8年第 5期 唐玲等 酵母 的分子 生物学鉴定 8 7 实 时监 测整 个 P C R进 程 的 定 量分 析 方 法 该 方 法 被认 为 是 现 在 检验 低 丰度 的 D N A病 原 体 的 临 床 样 本 的最 灵 敏 的方 法 故 在 流 行 病 的早 期 探 测 和 分类 有很 重 要 的作 用 利 用 实 时 P C R 系统 和 种 属 特 异 酶 来 对 c a n d i d a s p 和 果 汁 腐 坏 酵 母 进 行 检 测 和 鉴 定 中应用前景广阔 1 7 1 8 为 了使检测更加有效 在 探 测 和 鉴定 的 过程 中 研 究 者 通 常 利 用 特 异 性 的基 因序 列 的 表 达 情 况 来 帮 助 判 断 T r a m a 首 次 通 过 实 时 P C R 与 焦 磷 酸 测 序 联 用 的 方 法 来 对 C a n d i d a v a g i n i t i s 相 关 c a n d i d a s p 进 行 探测 和 研究 并 证 实 了 2种 方法 联 用 在 对 C a n d i d a v a g i n i t i s 相 关 c a n d i d a s p 的研 究 中的重 要 作用 3 3 基 因芯 片 随 着人 们 对 酵母 基 因组 全 序 列 的信 息 的掌 握 研 究 者 搜 集 到 大 量 的探 针 并 将 其 固 定 在 一 定 的 介 质 上 这 些 探 针 能 够 扩 增 出基 因 组 上 的 O R F或 者 原位 表 达 一些 序 列 以达 到 检 测和 鉴 定 的 目的 目前 C a n d i d a a l b i c a n s的基 因芯片 的研究 已经初见 成效 4展 望 随着 分子 生 物 学 的发 展 越 来 越 多 的 方法 被 广 泛 应 用 于酵 母 分类 鉴 定 的 工作 中 大 多 数 的酵 母 可 以通 过其 中的 一些 方 法快 速 准确 的 鉴 定 出来 但 是 对 于一 些 通过 一 种 方法 难 于鉴 定 的种 类 可 以利 用 两 种或 多 种技 术 联 用 以达 到 鉴定 的 目的 对 致 病 性 酵母 如 C a n d i d a s p 的检测 和鉴定研究 则多利 用 灵敏度更高 检测更加快捷的方法 如实时 P C R 基 因芯片等方法 随着技术 的进步 用于酵母鉴定的 数 据 资料 在 不 断 的 更 新 和 完善 酵母 的 分 类 和 鉴 定 将 会更 加 快 速精 确 参 考 文 献 l P e t e r s o n S W Ku r t z ma n CP S y s t A0 p l Mi c r o b i o l 1 9 91 1 4 1 2 4 1 2 9 2 Ku r tz ma n CP Ro bn e t t CJ An t o n i e v a n L e e u we n h o e k 1 9 98 7 3 3 3 1 3 71 3 J a c k WF Te u n B e t a1 I n t J S y s t E v o l Mi c r o Bi o l 2 0 o o 5 0 1 3 51 1 3 71 4 R0 s aLF F e m6 n d e z Es p i n a r MT e t a 1 Ant ani e v a nL e e u we n h o e k 2 O O 4 8 5 1 7 5 1 8 5 5 J a me s S A Ca i J e t a 1 S y s t Ba c t e r i o l 1 9 9 7 4 7 4 5 3 4 6 0 6 Ta k a s h i S Ma s am i t s uN e t a 1 J o u rnalo fCh mc alMi c r o b i o l o g y 2 0 0 2 4 0 5 1 8 2 6 1 8 3 0 7 Es t e v e Z B Be l l o c h C e t a 1 J o u rna l o f S y s t e ma t i c Ba c t e r i o l o g y 1 9 9 9 4 9 3 2 9 3 3 7 8 G u i l l am 6 n J M S a b a t 6 J B a r r i o E e t a 1 A r c h Mi c r o b i o l 1 9 9 8 1 6 9 3 8 7 3 92 9 S t e ff a n P V a z q