实验四T-A连接(克隆).ppt_第1页
实验四T-A连接(克隆).ppt_第2页
实验四T-A连接(克隆).ppt_第3页
实验四T-A连接(克隆).ppt_第4页
实验四T-A连接(克隆).ppt_第5页
已阅读5页，还剩10页未读， 继续免费阅读

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

实验四T A连接 克隆 赵建军张龚炜2018 10 20 一 实验目的 学习和掌握DNA连接的原理和方法理解T A连接的优缺点理解蓝白斑筛选的原理和方法 二 实验原理 DNA连接反应 transformation 利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起 成为一个完整的重组分子 载体 vector 指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段 目的基因 转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子 T 载体 聚合酶链反应 PCR 产物的克隆载体 两侧3 端各多出一个脱氧胸腺嘧啶核苷酸 T 由于PCR产物两侧3 端通常含单个脱氧腺嘌呤核苷酸 A 与T载体之间的A T互补性可提高PCR产物克隆的效率 二 实验原理 二 实验原理 自制T载体 XcmI 5 CCANNNNN NNNNTGG 3 二 实验原理 一些载体 如PUC系列质粒 带有 半乳糖苷酶基因 lacZ 的调控序列和N端 片段146个氨基酸的编码信息 该编码区中含有多克隆位点 可用于构建重组子 这种载体适用于仅编码lacZC端 片段的突变宿主细胞 因此 虽然宿主和质粒编码的片段都没有lacZ活性 但它们同时存在时 片段与 片段可通过 互补形成具有酶活性的 半乳糖苷酶 由 互补而产生的LacZ 细菌在诱导剂IPTG 异丙基硫代半乳糖苷 的作用下 在生色底物X Gal存在时产生蓝色菌落 二 实验原理 而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后 几乎不可避免地破坏 片段的编码 使得带有重组质粒的LacZ 细菌形成白色菌落 这种重组子的筛选 称为蓝白斑筛选 三 T A连接 克隆 的材料 三 T A连接 克隆 的材料 材料 特定的感受态大肠杆菌 DH5a DH5b Top10 Bl21等 PCR试剂 DNA纯化试剂盒 T载体 DNA连接酶 X Gal IPTG LB平板 Amp抗性 蛋白胨1 酵母粉0 5 NaCl1 琼脂1 5 0 5mg mlAmp 三 T A连接 克隆 的材料 四 T A连接 克隆 的过程 1 克隆DNA片段的准备 PCR反应 四 T A连接 克隆 的过程 PCR产物纯化 离心柱法结合 加入5倍体积的结合液 混合 过柱 将PCR产物 结合液混合物加入离心柱 12000rpm离心1min 弃收集液 漂洗 向离心柱中加入600ul漂洗液 12000rpm离心1min 弃收集液 重复一次 12000rpm离心3min 洗脱 离心柱套入一个1 5mlEP管 向离心柱加入20ul超纯水 停留2min 12000rpm离心1min 将收集液返回离心柱 重复离心3min 保留收集液 纯化DNA产物 备用 1 克隆DNA片段的准备 PCR产物纯化 四 T A连接 克隆 的过程 2 T A连接 PCR产物 T载体连接16 24 连接2 10h 四 T A连接 克隆 的过程 3 连接产物转化大肠杆菌并通过蓝白斑筛选和抗性筛选阳性克隆 IPTG 异丙基硫代 D 半乳糖
人人文库> 全部分类> 教育资料 > 课件下载

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论