血清碱性磷酸酶活性测定.ppt

血清碱性磷酸酶活性测定 磷酸苯二钠法 ALP 姓名 刘慧班级 20104289学号 2010415125 主要内容 实验目的 实验原理 实验器材与试剂 实验操作 计算 临床意义 注意事项 思考 实验目的 掌握酶活力测定的一般方法掌握血清中ALP活力测定方法掌握血清中ALP测定的临床意义 思考 如何测定酶活力的大小 酶活力 酶催化某一化学反应的能力 其衡量的标准是酶促反应速度的大小 酶促反应的速度 常用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示 反应速度 活力 酶活力测定方法 终止测定法 或定时法 本次实验的方法通常是酶作用一段时间后 加入强酸 强碱 蛋白沉淀剂等终止酶促反应 测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量 计算酶促反应的平均速度 连续监测法 连续监测法是指每隔一定时间 2 60s 连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据 求出酶反应初速度 间接计算酶活性浓度的方法 适用于自动生化分析仪目前已取代固定时间法而成为临床实验室测 什么是ALP 碱性磷酸酶ALP是一组在碱性环境中水解磷酸酯的酶类 来源 广泛分布于人体的骨 肾 肝 肠 血清 胆汁等部位 但骨骼 牙齿 肾和肝脏中含量较多 正常人血清中ALP主要来源于肝脏 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶 即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去 并生成磷酸根离子和自由的羟基 这类底物包括核酸 蛋白 生物碱等 而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化 碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力 实验原理 测定ALP的方法主要分为两种一是测定底物解离下的磷酸根来计算酶活力 如 甘油磷酸钠法 但存在血清本身有磷酸根的缺点 二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物 这种方法又可分为 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色 如对硝基苯磷酸二钠 PNPP 法 在PH 10的环境中 ALP催化磷酸苯二钠水解 苯酚和磷酸氢二钠苯酚与4 氨基安替比林 色素原该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚胺衍生物测定红色物质的吸光度就可以计算酶活力的大小 磷酸苯二钠 H2O ALP PH 10 苯酚 磷酸氢二钠 苯酚 4 氨基安替比林 铁氰化钾 醌亚胺衍生物 试剂与仪器 一 0 1mol L碳酸盐缓冲液 含4 氨基安替比林 4 氨基安替比林 淡黄色结晶 熔点109 溶于水 苯和乙醇 微溶于乙醚 4一氨基安替比林用量与吸光度成正相关 需准确加入 铁氰化钾用量不足时 反应不完全 测量结果偏低 因此铁氰化钾用量必须加足或稍稍过量 二 20mmol L磷酸苯二钠溶液 三 铁氰化钾的硼酸溶液 四 酚标准工作液 器材 5ml移液管 1ml移液管 加样枪 分光光度计 1cm比色皿37 C水浴锅 实验操作 取4支试管 如下操作 立即混匀 用510nm波长 红色醌物质的最大吸收波长 比色 以蒸馏水调零点 读取各管吸光度 保持反应时温度是均衡的 37 C 计算公式ALP活性金氏单位定义 每100ml血清再37摄氏度时与底物作用15分钟 产生酚1mg为1金氏单位 ALP活性 At Ac As Ab 0 05 100 金氏单位 参考值 成人 3 13金氏单位 儿童 5 28金氏单位 注意事项 酚标准液开后不能久置 底物液不能含有酚 若含酚则显红色 说明磷酸苯二钠已分解 不宜使用 加入铁氰化钾后必须迅速混匀 为了改变PH来终止酶促反应 否则有影响 偏大 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作用 此液应避光保存 如出现蓝绿色即作废 临床意义 在临床上 血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标 1 血清ALP活性升高肝胆疾病 阻塞性黄疸 急性或慢性黄疸性肝炎 肝癌等 骨骼疾病 由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中 引起血清ALP活性增高 如纤维性骨炎 成骨不全症 佝偻病 骨软化病 骨转移癌和骨折修复愈合期等 2 血清ALP活性降低 比较少见 主要见于呆小病 ALP过少症 维生素C缺乏症 思考题 1 本次实验是用的什么方法 终止剂是什么 为什么加入铁氰化钾硼酸液后必须迅速混匀 有何影响 答 终止法 终止剂是铁氰化钾硼酸液 硼酸改变了PH 使其不再处于最适PH B管与C管在实验中有何作用 不设两管有何影响 答 做参比溶液 3 实验过程两次水浴保温 一次5min 一次15min 意义相同吗 有何区别 答 不同 前者是达到最适温度 后者是反应时间 4 用标准曲线如何设计本实验操作过程 标准曲线法 取试管按表操作 立即混匀 选择波长510nm 用零号管调零 读取各管吸光度 并与相应酶金氏单位对应 绘制校正曲线 其他方法 磷酸对硝基酚连续监测法在碱性条件下 碱性磷酸酶将无色磷酸对硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚 在405nm测定对硝基苯酚生成的速率 这个速率与血清中ALP活性成正比 反应需要Mg2 作为激活剂 实验小结 磷酸苯二钠比色法水解速度快 故保温时间较短 该法灵敏度较高 显色稳定 不需去蛋白 操作简单 快速 磷酸苯二钠比色法水解速度快 故保温时间较短 该法灵敏度较高 显色稳定 不需去蛋白 操作简单 快速 但与磷酸