RNA干扰技术基本原理与应用课件.ppt

RNA干扰技术基本原理与应用 什么是RNA干扰 RNA干扰 RNAinterference RNAi 又称转录后基因沉默 post transcriptionalgenesilencing PTGS 是指将特异性同源双链RNA dsRNA 导入到细胞内 使目的基因的不表达或表达水平下降 2001 2002年连续被Science评为年度十大成就 目前应用的基因干扰技术 DNA水平的基因干扰技术基因敲除技术寡核苷酸与双链DNA杂交采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子 目前应用的基因干扰技术 mRNA水平的基因干扰技术用反义RNA技术阻遏翻译过程 破坏内源性mRNA设计寡核苷酸来破坏与mRNA结合的蛋白质 使mRNA不稳定双链RNA干扰技术 RNAi RNAi的发现和发展历程 1984年 Jonathan研究小鼠L细胞时发现反义mRNA会干扰同源基因的表达 机制不清1990年Jorgensen等矮牵牛颜色加深实验 共抑制 co suppresion RNAi的发现和发展历程 1995年SuGuo和KenEmphues反义RNA阻断秀丽小杆线虫par 1基因的表达实验首次发现RNA干扰现象1998年AndrewFire和CraigMello发现单链RNA抑制作用较弱 而纯化的dsRNA可高效 特异地抑制基因的表达Nature1998 391 806 11正式提出RNA干扰的概念 RNAi的发现和发展历程 1999年Tuschl等报道在哺乳动物中也存在RNAi2001年Berstein等提出只有22核苷酸dsRNA才有特异性的阻断效应 并发现体内分解dsRNA为siRNAs short smallinterferingRNA 的DICER酶 RNAi的发现和发展历程 2002年Novina等用RNAi技术实现了对HIV 1病毒的阻抑2004年Morris等用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制Science2004 August27 305 1289 1292 RNAi的主要特点和优势 诱导转录后水平的基因沉默具有高度的特异性抑制基因表达的效率非常高可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去 基因沉默系统化 siRNA与反义寡核苷酸 核酶 脱氧核酶 共同点特异性靶向性 siRNA与反义寡核苷酸 核酶 脱氧核酶 不同点独特的双链结构需要Dicer RdRp 解旋酶 激酶等协同因子siRNA本身无催化活性在细胞内可能具有相对的稳定性具有一定的可遗传性 RNAi的主要过程 启动阶段dsRNA 500nt左右最佳 被Dicer酶特异性识别 以一种ATP依赖的方式逐步切割成siRNA长度 21 25nt结构 3 端悬垂两个未配对的碱基UU 细胞中内源性dsRNA的形成 基因组中DNA反向重复序列的转录产物同时转录反义和正义RNA病毒RNA复制中间体以单链RNA为模板由细胞或病毒的RNA依赖RNA聚合酶 RdRp 催化合成dsRNA Dicer酶 RNAaseIII超家族成员 结构中包括一个螺旋酶结构域 两个RNA酶 结构域 一个双链RNA结合位点对单链RNA没有活性对200 500nt的dsRNA作用效果最好 能降解成25nt左右的siRNA广泛存在 RdRp RNAdependentRNApolymerase 使异常的RNA转变为dsRNA参与细胞内dsRNA和siRNA的扩增siRNA与靶mRNA的结合可激活RdRp 形成大量的dsRNA RNAi的主要过程 效应阶段RNA诱导沉默复合体 RNA inducedsilencingcomplex RISC 的形成siRNA 核酸内切酶 外切酶和解旋酶RISC的激活 ATP依赖的解双链过程在siRNA反义链的指导下 RISC特异性切割 降解靶mRNA 导致基因表达失活 RNAi技术的实验方法 siRNA的设计原则序列大小19 21nt 最好以A或G开始从mRNA的AUG开始 寻找AA二连序列 作为潜在的RNAi靶位点不要针对5 和3 端非编码区 untranslatedregions UTRs RNAi技术的实验方法 siRNA的设计原则设计2 4个序列 BLAST比对基因序列以确保序列设计的特异性优先选择GC含量30 50 的序列设计适当的阴性对照序列 阴性对照序列的设计 特异性siRNA中的碱基进行随机排列 且行BLAST基因比对AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGATTCGTGCTCAATGCAATCG在特异性siRNA引入1 2个错配碱基AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGAGCCTTAGTTTAAATCCTAG 目标序列筛选的相关网站 http www ic sunysb edu Stu shilin rnai htmlhttp sfold wadsworth org sirna pl 查找已经证实的siRNA的网站 siRNA的制备方法 体外制备方法化学合成siRNA体外转录获取siRNA利用Dicer或RNase 消化长的dsRNA成siRNA 化学合成法制备siRNA 优点 纯度高合成量不受限能被标记缺点 价格昂贵 合成周期长用途 已经找到最有效的siRNA的情况下 需要大量siRNA进行研究 体外转录法制备siRNA 优点 简单成本低速度快毒性小稳定性好缺点 反应规模和量始终有一定的限制用途 筛选siRNAs 特别是需要制备多种siRNAs 2020 1 29 27 可编辑 消化法 siRNAs鸡尾酒 优点 无需检测或筛选多个siRNA序列产生多种siRNAs混合体 保证有效的目的基因沉默缺点 有可能引发非特异的基因沉默用途 快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 2020 1 29 29 可编辑 siRNA的制备方法 细胞内制备方法依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNA通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取siRNA siRNA载体 依赖RNA聚合酶III启动子 polIII 操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达 人源U6启动子鼠源的U6启动子人H1启动子polIII可在细胞中表达许多的小分子RNA 通过添加一串 3 6个 U来终止转录的需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链再克隆到载体中 表达载体法制备siRNA 优点 可以进行较长期研究 载体可以在细胞中持续抑制靶基因达数星期或更久缺点 需要进行克隆 周期长质粒载体表达效率较低用途 唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法 基于PCR的siRNA表达框架 SECs 组成 RNApolIII启动子发夹结构siRNARNApolIII终止位点制备 PCR 无需克隆和测序 用SECs制备siRNA 优点 可直接由PCR得到 方法简便 时间短在PCR片段两端添加酶切位点 筛选出最有效的siRNA可用于构建表达载体可以用来筛选特定研究体系中启动子和siRNA的最适搭配 用表达框架制备siRNA 缺点 PCR产物很难转染到细胞中不能进行序列测定 PCR和DNA合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想用途 筛选siRNA序列在将siRNA克隆到载体前筛选最佳启动子 shRNA shorthairpinRNA 文库 Nature2004 428 427 431 25March 针对 9 610humangenes5 563mousegenes构建成 28 000个shRNA表达盒 cassettes 商品化试剂盒 ExpressionArrest 美国冷泉港实验室OpenBiosystems公司 网上数据库中选择特定的shRNA克隆 无需再耗时耗力进行siRNA的设计 合成和验证过程 CAM 氯霉素抗性基因hr 同源重组位点Barcode 每个shRNA独特的识别序列MSCV 病毒载体骨架PKG Puro 哺乳动物细胞中载体稳定性的选择Kan oriT RK6 逆转录病毒信号序列 siRNA转染细胞 磷酸钙共沉淀电穿孔法DEAE 葡聚糖和polybrene机械法 显微注射和基因枪阳离子脂质体试剂 提高转染效率的方法 纯化的siRNA避免使用抗生素避免RNA酶污染较低传代数的细胞合适的转染试剂合适的阳性对照荧光标记的siRNA RNAi技术的应用 基因组功能研究的新方法研究信号传导通路的新途径开展基因治疗的新策略 抗病毒 抗肿瘤等 筛选药物靶点的新工具 RNAi技术抗病毒 作用阻止病毒入侵 抑制病毒的复制和转录自然界中普遍存在在医学上的应用RNA病毒 如HIV HCV 脊髓灰质炎病毒DNA病毒 如HBV RNAi技术阻止HIV的入侵 Novina将针对CD4的dsRNA导入能表达CD4 CCR5 CXCR4的Magi2CCR5细胞系 能使细胞表面CD4表达减少75 转染后60小时后 再用HIV感染 结果发现CD4 siRNA转染的细胞很少有包涵体出现其它试验的受体 CCR5 CXCR4 RNAi技术抑制HIV的复制 将HIV 1编码rev的基因和同源的dsRNA共转染到293细胞中 r