细胞光散射特性的研究发展及应用综述-万国锋-杭市中.doc

细胞光散射特性的研究发展及应用综述 万国锋1 楼晓敏1 蔡双双2 曾碧新2*1(杭州市中医院设备科，杭州 310007)2（温州医科大学生物医学工程系，温州 325035）摘要：细胞是生命活动的基本单位,研究细胞的光散射特性在医学领域有着重要的地位，特别是对分析细胞的分群，细胞病变的检测，疾病的诊断和治疗有着重要的指导意义。本文在介绍细胞光散射的基本原理后，重点阐述了以球形模型的光散射技术测量细胞大小，形状等信息的发展历史及其进展情况。关键词：细胞光散射特性 球形模型 光散射技术The development and application of light scattering property of cellsWAN Guo-Feng1 LOU Xiao-Min1 CAI Shuang-Shuang2 ZEN Bi-Xin21(Equipment Department, Traditional Chinese Medical Hospital of Huang Zhou,Huang Zhou310007,China)2(Department of Biomedical Engineering,Wen Zhou Medical University,Wen Zhou325035,China)Abstract:Cell is the basic unit of life actitivy.Studying the light scattering property of cells play an important part in biomedical field, especially for cells classification, pathological changed cells detection, diseases diagnosis and treatment.In the thesis,the basic principle of cell light scattering is given first.Then the development history and process of measuring cell sizes and shapes by using light scattering technique of spherical model is mainly presented.Keywords: light scattering property of cells spherical model light scattering technique引言： 细胞是生命活动的基本单位,对细胞大小分布和形体特征的认识几乎受到生命科学每个领域的关注,特别在临床医学应用方面,许多疾病的辅助诊断、疗效观察、预后判断都依赖于对细胞形态特征的识别。目前,对细胞大小分布和形态分布动态识别较先进的方法是光散射方法。生物细胞的光散射主要是由光在细胞及细胞核边缘的衍射,细胞质、细胞核及周围介质的不同折射率的折射;不同光学边界的反射;细胞内的吸收等因素所造成的。因此,生物细胞的光散射包含了有关细胞尺寸(或细胞群尺寸分布)、形状、容积、内部结构以及内容物含量等丰富的信息,但是,从理论上得到真实细胞光散射方程的解析解是不现实的,往往都是基于某种模型和某种算法1.2.3。本文在介绍了细胞光散射的基本原理后，重点就目前国内外细胞散射常采用的几种模型及细胞散射在生物医学上的应用进行了阐述。1. 细胞光散射的基本原理光散射现象是由吸收、衍射、透射、折射、镜面反射以及粒子介质界面的平面波传播之间的相互作用引起的。严格的光散射的电磁场理论是将光波看作电磁波，在一定的颗粒的形状和尺寸所决定的边界条件下，对颗粒内部和外部区域的Maxwelll方程求解。得到振幅函数和强度函数的表达式。米氏（Mie）散射理论4即是在这种情况下对均匀介质中的均匀球体在平面单色光照射下求得的严格数学解，适于任何粒子尺寸，但它的解的形式比较复杂。在球形颗粒的某些范围内，人们用一些近似的公式来描述，在生物细胞散射中用的最多是瑞利-甘斯-德拜（Rayleigh-Debye-Gans）（RDG）散射来替代米散射5。生物体的形态结构和生命活动最基本的单位是细胞，人体细胞就有二百余种6.7。细胞通常由细胞膜、细胞质和细胞核三部分构成，由于细胞内在结构和自身的表面张力以及外部的机械外力，细胞的形态相对比较稳定，所以可以应用一种能符合细胞形态的散射模型描述细胞的散射特性，同时由于细胞的大小差异较大，不同形态的细胞器，细胞的形状也是多样化的，如有球状、多面体、纺锤体和柱状体，所以也不能用一种散射模型来描述不同细胞的散射特性。2.常见的细胞散射模型及其在生物医学上的应用2. 1球形模型的瑞利-甘斯-德拜散射 1910年后,瑞利和R.甘斯一起发展了散射理论，导出适合于有限大小的球的散射公式。1947年P.德拜将其推广用于高聚物溶液。他们共同的结论通常称为瑞利-甘斯-德拜理论。应用瑞利-德拜-甘斯近似(或玻恩近似)模型理论，散射光的角强度8可由下式给出: （2-1）式中为探测角 ，时表示电场矢量垂直于散射面的散射强， 时表示电场矢量平行于散射面的散射光强。为入射光的强度 ，表示微粒到观察点的距离，为指微粒外传播区域内的传播常数，为入射光在真空中的波长。在实际应用中只要相对折射率接近于1，对任意大小的质点都适用,此理论可以把大质点的散射视作是一群独立的偶极振子的散射，因而比米氏散射理论简化了很多。由于人体血细胞的相对折射率接近于1，即 a(-1) 1可考虑使用瑞利-甘斯-德拜理论来描述生物血细胞的散射特性5. 目前国内外主要细胞检测分析设备主要基于球形模型下的瑞利-甘斯-德拜理论算法9.如流式细胞分析仪就是应用这样的模型和理论。在医学上应用这种模型理论对血细胞的大小,形态、内部成分来对细胞进行分类计数如：Kaye 等人10让单个细胞流过激光照射区,记录0到180内多个散射角度上(角度分辨率为115) 的散射光强分布,通过寻找极小光强角度位置并与计算机中存储的理论值相比较而得到该细胞的大小和折射率,进而根据多个细胞的大小和折射率对此细胞群分类和计数如：Salzman 等人11(1975 年)以人类白细胞为实验，以 488nm的激光在两个不同的角度上同时照射细胞，得到的细胞散射图谱上有三个明显不同分布高峰，之后对相应分布高峰的细胞加以分类和不同染色。对这些细胞进行细胞学检查表明，这三个峰分布的细胞分别是淋巴细胞，单核细胞和中性粒细胞，并且每组内该种细胞的数量是77%88%。Hoffman 等人12 (1980 年) 用90的细胞散射法对人体周围血液中的白细胞进行分类,但当用标记单克隆抗体的方法来检验时,发现用90散射法分出的淋巴细胞中含有的30 %的单核细胞。1983年， Ritchie 等人13以流式细胞技术和细胞抗原荧光标记技术相结合对人类淋巴细胞进行试验，试验表明散射角为90度的细胞激光散射和细胞荧光标记可以准确的分离人类白细胞中的淋巴细胞和粒细胞，同时指出荧光标记的放大作用，能提高淋巴细胞亚群分析的精确度，并将该项技术应用到移植学中如肾移植受体的细胞性质的研究中。然而对任何形状和大小的人体有核血细胞,，应用瑞利-甘斯-德拜理论对它们进行分类，也不能很好的描述细胞的真实分类情况。1986年，Sloot等人14通过改进RDG近似式的形状因子(Form Factor)P()，即用改进的RDG近似式(ModifiedRayleighDebye-GansMRDG)，给出了一个球壳模型来描述尺寸范围在血细胞大小范围内的弹性光散射。这个模型由两个同心球组成，里面的球代表细胞核，外面的球代表细胞质，实验结果15显示这种简单模型在前向散射上很适合任何形状和大小的有核血细胞并且跟那些复杂理论也符合得很好。2. 2球形模型的米氏散射 1908年,米氏(G.Mie)通过电磁波的麦克斯韦方程,解出了一个关于光散射的严格解,得出了任意直径、任意成分的均匀粒子的散射规律,这就是著名的米氏理论。根据Mie理论 ，以光强为，入射波长为的自然光平行入射到一直径为D的球形颗粒，在入射光是平面偏振光的情况下散射光强4为： （2-2）上式中为入射光的电矢量相对于散射面的夹角。米氏（M ie）散射理论描述的是各向同性球体的弹性光散射，把细胞及亚结构看成是一种各向同性球体，将细胞的米氏（M ie）散射图形与实验结果进行比较可得到细胞的大小和折射率等参数，这些参数是评价细胞特性，临床疾病的重要指标，因此有人应用米氏散射理论来测量细胞光谱，并分析得到的光谱数据来评价细胞特性。 Adam Wax,等人16利用角度相关的低相干性干涉的测量法a/LCI （angle-resolved low-coherence interferometry）来侧量细胞核和细胞亚结构的参变量，其中细胞核的参变量源于由米氏散射理论而细胞亚结构的参变量由亚结构的散射得出；又以单层培养生长的磷状细胞为例得到了细胞的平均折射率为1.066+-0.007，平均直径为9.9+-0.6m这一结果和显微照相经电脑分析处理后的到的数据平均直径10.6+-0.4m吻合的非常好，同时也得到了单层培养生长的磷状细胞的分数维为1.79+-0.1，这为细胞性质评价提供了一种新的方法与途径。RAJAN S. GURJAR17等人应用基于米氏散射理论的散射光谱成像技术得到了定量组织的空间参数分布图像，比如核的大小，形态的维数，染色质的浓度量等等这些和组织结构功能有光的参数，由于这些参数是诊断细胞发育异常的重要指标。最近这项技术应用到毫米级大小的生物组织区域的样品组织18，另有报道表明利用LSS成像技术可以区别人类皮肤底层的结构19.20。，作者试验表明组织图像中细胞核的大小精度可超过0.1 um，而此时像素大小为25um，光波波长为0.5um，所以散射光谱成像技术能为细胞的评价提供精确可靠的指标参数。也有一些人分析基于米散射理论的细胞散射数据，得到了细胞的特性参数，这为临床疾病的诊断提供了可靠的依据如：一些研究者用米氏散射的角度分布散射到生物组织上比如区别正常和癌变的组织21.22，并分析光动力疗法在癌症细胞上的作用23.24，同时也观察到了依赖于钙离子的浓度的线粒体形态的改变25。目前对临床疾病细胞进行的弹性散射光谱法也是基于米氏（Mie）散射理论的方法。应用这种方法在对鼠的结肠癌变的模型研究中，发现鼠结肠表皮下的毛细血管密度在AOM注射后两周有显著曾长、显示在癌变极早期过程中的恶性变化，对于这一点目前还没有细胞组织学和分子标示的技术能够达到这样的能力26除此外也有 ： Haringsma27通过内镜和光谱结合技术指出应用米氏散射的弹性散射光谱能测量发育异常的组织并通过巴雷特食管癌的病理检查对比，表明两者吻合的很好。Rollins and Sivak28等人也应用米氏散射的弹性散射光谱（没有能量耗损的散射）可以有效的提高临床内镜医师对发育异常的胃肠粘膜的诊断，同时也在用这种方法对膀胱癌进行诊断与研究。由上可知对于整个细胞的散射不仅可用米氏散射理论来描述，而且对于细胞器也有人用细胞器共聚焦散射理论29来描述细胞器散射，此时将单个细胞器看作同质的球形散射体,运用球形粒子的米氏（Mie）散射理论30.31,计算散射光振幅,最终得到散射光强表达式,由光强分布曲线来表征细胞器的粒径大小分布，所以米氏散射理论对细胞特性和疾病细胞的研究都有重要的意义。2. 3椭圆形模型散射理论对于有形体、有核的真实细胞采用两个同心旋转椭球模型来表示,内、外椭球分别表示细胞核与细胞质，表达式为: （2-3） （2-4）上式中为细胞的形体因子, a、b 分别表示内、外椭球的短半轴长度，由这一椭圆模型等相关参数，可的得到一个相应形态因子 32，形态因子则包含了细胞大小、形状和折射率等信息, 然后以瑞利- 德拜- 甘斯近似散射理论相结合，经反演计算可得到到细胞大小的分布。由于椭圆模型理论通过改变形体因子能较好地表示相应形体的细胞,其散射理论计算的结果通过散射幅值分布的变化反映了其细胞形体的变化,，从而为细胞形体反演理论的研究提供了理论依据38。吴大建等人提出一种新型的同心椭球构成的同心椭球(CEM)模型来模拟有核细胞,以瑞利-德拜-甘斯近似理论为基础,对细胞内不同部分的传播常量加以修正,用该模型代替球系列模型,研究其光散射特性。结果表明同心椭球模型更精确地反映了非球形有核细胞光散射的真实情况,同时根据其前向、侧向及后向光散射精细谱，可以在庞杂的细胞中辨别不同的细胞类型，以及在变形的病变细胞、细菌等进行分析、识别、分类和计数等应用中都具有较高的应用意义33 。王亚伟、崔青义、卜敏、洪云、刘莹、吴大建等人基于瑞利-甘斯-德拜理论和双椭球核式CEM模型在实际应用中的不足，从极化率分布函数的修正出发,建立了任意入射角下的MCEM模型(CEM的修正模型)，得到了不同入射角下有核细胞光散射强度分布与有核细胞相关物理特征量的动态响应关系； 对有核细胞光散射强度分布进行拟合，得到了有核细胞光散射强度分布函数。误差分析表明：拟合结果可有效地应用于真实细胞光散射测量中的数值反演计算34。3.结束语散射光谱法测量细胞适用范围广，其测量范围宽、精度高、重复性好当与计算机配合使用时可以实现快速、在线、实时测量使测量结果达到很高的智能化程度。需要指出的是，上述光学法测细胞的原理都是基于少数几种模型理论来分析，目前对生物组织中的散射体的形态大小的研究甚少，在比较理想的状况下将组织中的散射体等效为一定大小的球形散射颗粒而进行研究，也多是在细胞光散射特性的基础上获得细胞水平组织图像，因此进一步的研究需要对生物组织结构特点的进行光谱分析，以及生物组织内部存在的散射体的光学特性进行研究探讨，以便从细胞，组织水平上从光谱分析角度来揭示细胞结构功能的关系，为临床疾病的诊断提供依据。参考文献1 Neukammer Jorg , Gohlke Carsten , Hope Andreas , et al . 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