实验方法-1-核酸基因克隆.doc

目录一、植物组织DNA提取步骤王 芳1二、核酸胶回收方法杨玉萍1三、酶切实验流程曹文瀚1四、DNA定点诱变载体构建方法陈雪娜4五、拟南芥cDNA质粒文库的构建李丽娟6六、植物细胞RT-PCR杨玉萍12RNA提取及纯化（材料不同，方法稍有不同）13普通PCR15半定量PCR17七、实时荧光定量PCR李云爽17引物设计17上样18Real time PCR仪器使用：19结果分析25作图30八、ABRC CD4-10/22梁明炜34一、植物组织DNA提取步骤水稻全基因组提取步骤（参考CTAB法） 收集水稻新鲜叶片，在液氮中速冻； 液氮环境下，在研钵中迅速研磨，转入1.5 mL小指管； 加入0.8 mL CTAB充分混匀； 65 C水浴30 min； 加入等体积氯仿，充分混匀； 离心4 C，13,000 rpm，10 min； 移上清至新的小指管，加入0.7倍体积的异丙醇，翻转混匀，静置5 min； 离心4 C，14,000 rpm，30 min； 弃上清，用70 %的乙醇清洗两次，风干； 加入ddH2O若干（30 L)溶解，测定浓度后于-20 C保存。二、核酸胶回收方法 胶回收步骤（一般都严格按照我们实验室购买的胶回收试剂盒说明书的步骤做即可，上面的注意事项也写的很清楚。） 测定质粒DNA浓度NANODROP仪器测定：用ddH2O将质粒DNA稀释一定倍数（如10倍）或不用稀释，备用待测。用ddH2O两次调零，然后加2 l质粒，直接读取浓度。三、酶切实验流程1 贮存条件大多数限制性内切酶保存在-20。只有少数内切酶(若储存时间超过30天)建议保存在-70。详细储存信息参考NEB内切酶使用说明书。反应缓冲液和BSA也应保存在-20。每管试剂的管壁标签都会标有使用期限，注意及时更新过期的试剂。2 确定酶切位点通过质粒图谱软件（如Vector NTI 12.0）确定需要酶切片段的酶切位点，也可以通过NEB的网站在线查询，如下：/tools-and-resources/interactive-tools/enzyme-finder。 3 NEB限制性内切酶酶切体系的设置50 l单酶切体系成分体积内切酶1l质粒DNA1 g10X NEBuffer5 l (1X)100X BSA（依需要加）0.5 l(1X)无菌水补至50 l50 l双酶切体系成分体积内切酶各1l质粒DNA1 g10X NEBuffer5 l (1X)100X BSA（依需要加）0.5 l(1X)无菌水补至50 l反应步骤：除内切酶，所有样品在EP管中混匀，低速离心后，加入相应体积的内切酶。根据内切酶的反应温度设定水浴锅或Heat-Block的温度（采用Heat-Block，EP管一定要用1.5 ml的规格，过小或过大的管体不易充分受热），反应过夜，但不能超过16 h。注意事项a) 限制性内切酶室温下极易失活，所以只有在所有样品加完后，才能将内切酶从-20冰箱中取出，并一直置于冰上。取完内切酶后需要立即放回原处。b) NEB公司每种限制性内切酶均配有相应的10X NEBuffer，在加样之前，需要根据自己所需要的内切酶选择合适的buffer。如果是双酶切的话，选择两种酶活力最高的buffer即可。c) 参考NEB产品目录上的内切酶的要求，加入终浓度为100 g/ml的BSA(1：100稀释)。在不需要BSA的酶切体系中加入BSA不会影响酶切效果。d) 质粒DNA要避免酚、氯仿、酒精、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染。e) 通常情况下，采用5-10单位酶量/g DNA，基因组DNA采用10-20单位酶量消化1小时。每g 底物DNA建议在50 l反应体系中消化。4 FastDigest 快速内切酶酶切体系的设置成分体积质粒DNAPCR产物基因组DNA10FastDigest Green Buffer/10FastDigest Buffer2 l2 l5 lDNA1 g0.2 g5 gFastDigest 内切酶1 l1 l5 l无菌水补至20 l补至30 l补至50 l反应步骤：除内切酶，所有样品在EP管中混匀，低速离心后，加入相应体积的内切酶。根据内切酶的反应温度（按照下列链接查询内切酶的适应反应温度）设定水浴锅或Heat-Block的温度（采用Heat-Block，EP管一定要用1.5 ml的规格，过小或过大的管体不易充分受热），设定内切酶的反应时间（按照下列链接查询内切酶的适应反应时间），一般5-30 min。在线查询Thermo Scientific FastDigest 快速内切酶反应条件：/restriction-and-modifying-enzymes/restriction-enzymes/reaction-conditions-for-fastdigest-enzymes-chart/注意事项：a) FastDigest快速内切酶采用两种通用的反应缓冲液，即10FastDigest Buffer 和10FastDigest Green Buffer，10FastDigest Green Buffer是包含loading buffer的酶切缓冲液，反应完后可以直接上样电泳。10FastDigest Green Buffer也能用来代替普通的loading buffer。图1 10FastDigest Green Buffer 上琼脂糖凝胶可见光下示意图。1泳道是电泳前，2泳道是电泳后。蓝色条带大小为3-5 kb，黄色条带大小为10 bp。b) 我个人感觉1 l FastDigest快速内切酶反应时间30 min并不能完全作用于1 g的质粒DNA。所以，FastDigest快速内切酶仅适用于酶切鉴定目的条带的插入，并不适用于用来克隆基因和构建载体。四、DNA定点诱变载体构建方法图一、突变位点载体示意图1、步骤：1、确定突变位点的密码子序列2、设计引物P1：要扩增片段的开始引物（加ATCC接头、20-30 bp、不含位点突变）P2：在位点突变下游20 bp处设计长度约为40 bp的引物（含有位点突变、反向互补序列）P3：在位点突变上游20 bp处设计长度约为40 bp的引物（含有位点突变、正向序列）P4：要扩增片段的末端引物（根据情况加终止密码子、反向互补序列、不含位点突变）3、利用PCR技术，分别以引物组P1+P2和P3+P4扩增得到具有突变位点两段序列（P12、P34）4、胶回收P12、P34两个片段，然后以这两个片段为模版，再以P1和P4为引物做PCR反应扩增得到具有突变位点的全长片段P14。5、胶回收P14片段，连接到pENTR载体上，化转DH5，涂在抗性板上，挑菌鉴定先菌液PCR方法鉴定，然后对电泳结果为阳性的质粒进行测序。2、以AtERF（At3G16770）蛋白磷酸化位点突变（把丝氨酸位点突变为丙氨酸或天冬氨酸）为例，进行阐述：图二、AtERF蛋白序列图如图所示，共有3个丝氨酸位点，突变组合如下：1位突变为无活性的丙氨酸A及持续活性的天冬氨酸D;2位突变为无活性的丙氨酸A及持续活性的天冬氨酸D;1、3位突变为无活性的丙氨酸A及持续活性的天冬氨酸D;2、3位突变为无活性的丙氨酸A及持续活性的天冬氨酸D;步骤：1、设计位点突变引物序列（用Vector NTI软件进行设计），红色表示突变位点序列，如下：S1-A1-P2GTTGATCGTGGCGATGCCGGCGGAGGAGTATAATTAGGAGS1-A1-P3TACTCCTCCGCCGGCATCGCCACGATCAACCGATCAGCCTS1-D1-P2GTTGATCGTGGCGATTCCGGCGGAGGAGTATAATTAGGAGS1-D1-P3TACTCCTCCGCCGGAATCGCCACGATCAACCGATCAGCCTS2-A2-P2GTTGATCGTGGCGCTGACGGCGGAGGAGTATAATTAGGAGS2-A2-P3TACTCCTCCGCCGTCAGCGCCACGATCAACCGATCAGCCTS2-D2-P2GTTGATCGTGGCTCTGACGGCGGAGGAGTATAATTAGGAGS2-D2-P3TACTCCTCCGCCGTCAGAGCCACGATCAACCGATCAGCCTS13-A13-P2GCTGATCGGTTGCTCGTGGCGATGCCGGCGGAGGAGTATAATTAGGAGS13-A13-P3CCGCCGGCATCGCCACGAGCAACCGATCAGCCTCCGGCGAAGAS13-D13-P2GCTGATCGGTTTCTCGTGGCGATTCCGGCGGAGGAGTATAATTAGGAGS13-D13-P3CCGCCGGAATCGCCACGAGAAACCGATCAGCCTCCGGCGAAGAS23-A23-P2GCTGATCGGTTGCTCGTGGCGCTGACGGCGGAGGAGTATAATTAGGAGS23-A23-P3CCGCCGTCAGCGCCACGAGCAACCGATCAGCCTCCGGCGAAGAS23-D23-P2GCTGATCGGTTTCTCGTGGCTCTGACGGCGGAGGAGTATAATTAGGAGS23-D23-P3CCGCCGTCAGAGCCACGAGAAACCGATCAGCCTCCGGCGAAGAS1-A1-P2：第1位丝氨酸突变为丙氨酸的P2引物；S1-A1-P3：第 1位丝氨酸突变为丙氨酸的P3引物;以此类推。2、利用PCR技术，以ERF为模板，引物组P1+P2（扩增400 bp）和P3+P4（扩增300 bp）扩增得到具有突变位点的ERF两段序列， 如图：3、胶回收由P12和P34扩增的两个片段，然后以这两个片段为模版，P1和P4为引物扩增得到全长750 bp具有突变位点的ERF，如图：4、胶回收片段，连接到pENTR载体上，化转DH5，涂在kan板上，挑菌，利用菌液PCR方法鉴定，同时挑选一部分测序。五、拟南芥cDNA质粒文库的构建通过酶促反应把poly(A)+ mRNA转变为双链DNA，进而将此DNA插入原核或真核表达载体，这已经成为分子生物学研究的基本手段。 拟南芥mRNA的提取1、材料收集取不同生长发育时期拟南芥材料，使文库尽可能多的包含拟南芥各个时期起作用的功能蛋白的mRNA 。1) 取拟南芥Columbia生态型野生型种子，消毒，无菌条件下，平铺于MS固体培养基上，密度要适宜。2) 2、4 ，春化2 天。3) 转移至光照培养箱中培养，16 h光周期,培养温度22 。4) 培养7 d后，将部分幼苗转移至营养土中，放置于温室培养，16 h光周期，培养温度22 。5) 收集生长7 d的幼苗，此时拟南芥植株处于四叶期，根的形态建成基本完成。6) 收集生长18 d左右的植株莲座叶，此时拟南芥植株基本完成营养生长，转至生殖生长时期。7) 收集生长28 d左右的植株的花及种子。8) 步骤5中的材料应尽可能吸干水，步骤6、7中的材料应先洗干净泥土，吸干水。均用标记好重量、日期、收集人姓名的50 ml的离心管收集，尽快放入液氮中。-80 ，保存。2、mRNA的提取（利用Invitrogen公司的FastTrack2.0mRNA Isolation Kit）1) 提前将需要使用的物品进行去RNAase处理。2) 用干净的液氮对研钵等迅速降温，取收集的材料，共约5g,研磨充分，3) 研磨充分，研磨过程中不断加液氮，直到材料呈白色粉末状。4) 用过滤膜将上清过滤到新的离心管中。5) 加入950 L 5 M NaCl溶液，充分混匀。6) 加入一小瓶oligo（dT），静置2 min。7) 将上述混合物放在脱色摇床上，轻摇60 min，4 ，3000 x g离心5 min，弃上清。8) 用20 mL Binding Buffer悬浮沉淀，颠倒混匀，4 ，3000 x g离心5 min，弃上清。9) 用10 mL Binding Buffer悬浮沉淀，颠倒混匀，4 ，3000 x g离心5 min，弃上清。10) 用10 mL Low Salt Wash Buffer悬浮沉淀，颠倒混匀，4 ，3000 x g离心5 min，弃上清。11) 重复步骤9至少4次。12) 用500 L Low Salt Wash Buffer重悬沉淀，加到吸附柱，4 ，5000 x g离心30 秒，弃离出液。13) 重复步骤12至少2-5次。14) 将吸附柱转移到新的离心管中，加入340 L Elution Buffer，混匀，4 ，5000 x g离心30 s。15) 再加入200 L Elution Buffer，混匀，4 ，5000 x g离心30 s。16) 丢掉吸附柱，用81 L 2 M sodium acetate和1350 L无水乙醇（-20 保存）充分混匀，沉淀mRNA，放在冰上15 min或-20 保存。17) 4 ，12000 x g离心20 min，倒掉上清，向沉淀中加入0.5 mL 70 %乙醇（-20 保存）18) 4 ，12000 x g离心5 min，倒掉上清，取沉淀。空气干燥20 min。19) 用20 L Elution Buffer溶解。-80 保存备用。20) 在Nanovue超微量分光光度计上测mRNA样品260 nm和280 nm的光吸收，通过吸收值计算mRNA样品的浓度，并判断mRNA样品的纯度。mRNA光吸收值和浓度换算公式：1OD260=40 g/mL。纯度判断方法：纯的mRNA，其OD260/OD280为2.0，若被蛋白或者酚污染，OD260/OD280比值明显低于此值。3、提取的mRNA反转录合成cDNA（利用Invitrogen公司的SuperScript Plasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning试剂盒）1、cDNA第一条链的合成1) 先在1.5 mL RNase free的eppendorf小指管内加入2 L Notprimer-adaptor，再加入5 g mRNA，此时总体积7 L。2) 温和混匀后，在70 温育10 min。在冰上预冷备用。3) 在RNA-Primer Mix小指中按如下体系加入下列试剂，在37 温育2 h。5First Strand Buffer4 L0.1 M DTT2 L10 mM dNTP Mix1 L双蒸水1 L总量15 L4) 将5 L SuperScriptRT加到上述混合物中，温和混匀，在37 温育1 h。5) 放在冰上，终止反应。2、cDNA第二条链的合成1) 在已合成cDNA第一条链的小指管（放在冰上）中按如下体系加入下列试剂，在16 温育2 h。DEPC-treated water91 L5Second Strand Buffer30 L10 mM dNTP Mix3 LE.coli DNA Ligase(10 units/L)1 LE.coli DNA Polymerase(10 units/L)4 LE.coli RNase H(2units/L)1 L总量150 L2) 将2 L（10 U/L） T4 DNA polymerase加到上述混合物中，温和混匀，在16 继续温育5 min。3) 放在冰上，加入10 L 0.5 M EDTA。4) 加入150 L配好的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混合溶液，充分混匀。室温、14000 x g离心5 min。5) 将140 L上层水相转移到新的1.5 mL RNase free的eppendorf小指管中。6) 加入70 L 7.5 M 醋酸铵，再加入0.5 mL 100%乙醇（-20 保存）。充分混匀。室温、14000 x g离心20 min，倒掉上清。7) 用0.5 mL 70 %乙醇（-20 保存）洗涤沉淀。室温、14000 x g离心5 min，倒掉上清。8) 将cDNA放在37 Heat Block10 min，挥发掉剩余的乙醇。3、添加EcoR接头1) 在已合成cDNA第二条链的小指管（放在冰上）中按如下体系加入下列试剂DEPC-treated water23 L5T4 DNA Ligase Buffer10 LEcoRAdapters12 LT4 DNA Ligase5 L总量50 L2) 16 温育至少16 h。3) 加入50 L配好的Tris-饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合溶液，充分混匀。室温，14000 x g离心5 min。4) 将45 L上层水相转移到新的1.5 mL RNase free的eppendorf小指管中。5) 加入25 L 7.5M醋酸铵，再加入150 L 100%乙醇（-20 保存）。充分混匀。室温，14000 x g离心20 min，倒掉上清。6) 用0.5 mL 70 %乙醇（-20 保存）洗涤沉淀。室温、14000 x g离心5min，倒掉上清。7) 将cDNA放在37 Heat Block 10 min，挥发掉剩余的乙醇。4、 去除Not末端1) 在加有EcoR接头的cDNA小指管（放在冰上）按如下体系加入下列试剂DEPC-treated water41 LReact 3 Buffer5 LNot酶4 L总量50 L2) 在37 温育2 h3) 加入50 L配好的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合溶液，充分混匀。室温，14000 x g离心5 min。4) 将45 L上层水相转移到新的1.5 mL RNase free的eppendorf小指管中。5) 加入25 L 7.5 M醋酸铵，再加入150 L 100%乙醇（-20 保存）。充分混匀。室温，14000 x g离心20 min，倒掉上清。6) 用0.5 mL 70 %乙醇（-20 保存）洗涤沉淀。室温，14000 x g离心5 min，倒掉上清。7) 将cDNA放在37 Heat Block 10 min，挥发掉剩余的乙醇。5、柱层析1) 用100 L TEN buffer溶解上述cDNA，放置于冰上。2) 将0.8 mL TEN buffer加到柱子最上端的中央，让其完全流经柱子，自然滴下。重复此操作4次。3) 准备20个标有1-20数字的小指管，并按顺序放在柱子的下方。4) 把溶于100 L TEN buffer的cDNA样品加到柱子最上端的中央，让其流经柱子的同时，标有数字的小指管按顺序收集从柱子下方流出的液滴。前两个小指管收集100 L，此后的小指管各收集1滴。同时，不断向柱子最上端的中央加100 L TEN buffer。5) 计算每个小指管中液滴的体积，并且把所有体积累加，直到总体积超过550 L时就不需要继续收集液滴，记录数据。6) 取总体积400 L至550 L范围内相对应的小指管。7) 把小指管中的液滴收集到一个小指管中，并计算总体积为162 L。8) 向上述小指管中加入5 L yeast tRNA，温和混匀，加入0.5倍体积的7.5 M醋酸铵，再加入2倍体积的100 %乙醇，充分混匀，室温，14000 x g离心5 min，弃上清。9) 用0.5 mL 70 %乙醇（-20 保存）洗涤沉淀。室温、14000 x g离心5min，弃上清。10) 将cDNA放在37 Heat Block10min，挥发掉剩余的乙醇。用20 L ddH2O充分溶解cDNA，-80 保存。11) 在Nanovue超微量分光光度计上测cDNA样品260 nm和280 nm的光吸收，可得知cDNA样品的浓度及纯度。纯度判断方法：纯的cDNA，其OD 260/OD 280为1.8，若被蛋白或者酚污染，OD 260/OD 280比值明显低于此值。4、cDNA连接到文库表达载体pCMV-BD按如下体系加样连接，16过夜组分体积1体积2文库表达载体pCMV-BD2 L2 LcDNA1 L2 LT4 DNA Ligase1 L1 LT4 Ligase Buffer4 L4 Ldd H2O12 L11 L总量20 L20 L 5、连接产物的电转化（电转DH5感受态细胞）1. 将5 L yeast tRNA，12.5 L 7.5 M醋酸铵加入到连接产物中。2. 加入70 L 100 %乙醇（-20 保存），充分混匀。室温，14000 x g离心20 min，弃上清。3. 用0.5 mL 70 %乙醇（-20 保存）洗涤沉淀。室温、14000 x g离心5 min，弃上清。4. 将cDNA连接产物放在37 Heat Block 10 min，挥发掉剩余的乙醇。5. 加5 L ddH2O溶解cDNA连接产物。6. 取25 L DH5感受态细胞置于冰上，完全解冻后，加入1 L cDNA连接产物，轻轻混匀，冰上放置几分钟。7. 将上述26 L混合物加入电转杯，电刺激一下，再加入1 mL S.O.C培养基，充分混匀，37 ，150 rpm振荡培养50 min。8. 将细菌涂抹在加有氨苄青霉素(Amp)的LB培养基平板上。9. 将平板于37 下倒置培养过夜。10. 次日，观察平板上菌落生长状况，并计数。6、连接产物转化效率的鉴定建议m(cDNA):m(pcDNA-BD) = 50ng:150ng。由于pcDNA-BD是从pcDNA-BD-GAL4经EcoR、Not位点双酶切后获得，会有部分载体自连，而由于cDNA质量对连接反应会有影响，可能导致连接产物的转化效率低，无法达到高文库库容，所以需要优化连接反应中载体与cDNA的比例，从而增加连接效率，提高连接产物的转化效率。7、大量抽提质粒构建质粒文库（qiagen试剂盒）按照说明书要求进行即可。8、文库质量的检验M12345678911121314151617102Kb-1Kb -1% TAE琼脂糖凝胶，上样20l,EB染色，Marker为genstar公司的DNA ladder（2000 plus） 从上面电泳图中可以看出cDNA插入片段的大小在1kb-2kb左右，17个单克隆中有14个单克隆有插入片段。鉴定插入效率估算为80%左右。 异源表达体系筛选拟南芥cDNA文库1. 初级文库的筛选1) 异源表达体系中目的基因（转录子）的捕获技术2) 确定阳性信号较好的初级文库2. 逐级分库，高通量筛选单克隆目的基因1) 初级文库的扩增：初级文库包含约5103-1104个单菌落质粒，在荧光显微镜下观察到的含绿色荧光的细胞中，起作用的插有目的因子的质粒在初级文库中仅占5103-1104之一，将阳性文库质粒重新电转入DH5中，invitrogen公司的DH5转化效率大于1106，也就是说阳性质粒如果转入感受态细胞中，相应的被扩增。将转化后的约1ml大肠杆菌稀释5000倍数，分10份涂抹在加有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB培养基平板上，包含阳性质粒的菌落在一个平皿上出现的概率为50%。2) 由阳性质粒可能在这10个加有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB培养基平板上，将平皿上的菌复制到滤纸上一份，同时将滤纸上的菌复制到另外的加有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB培养基平板上。（滤纸上保存分库质粒是分库的关键步骤，原因之一是可以将菌落固定；原因之二是滤纸上的菌落是可以通过分滤纸分开的；原因之三，可以保证用于转染的质粒对应的菌落一定在滤纸上。）3) 将10份滤纸上复制到平皿上的菌落全部收集到200ml含相应抗性的液体LB培养基中，大提质粒，标记为第一级文库A-1、A-10。（A代表初级阳性文库编号）4) 将A-1、A-10质粒和pUAS-GFP共转入HEK293a细胞中，观察荧光情况。5) 如果有阳性结果，则继续分库，进行下一步；如果没有阳性结果，说明有荧光信号的初级文库中的阳性质粒在转化中丢失，需要重新重复步骤1)和步骤2）。6) 在A-1、A-10中有阳性信号，以A-1为例。将A-1对应的滤纸分为6-8份，再次滤纸上的菌落复制到新的有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB培养基平板上。7) 将6-8份滤纸上复制到平皿上的菌落全部收集到200ml含相应抗性的液体LB培养基中，大提质粒，标记为第一级文库A-1-1、A-1-6/8。（A代表初级阳性文库编号）8) 实验操作同步骤4），从A-1-1、A-1-6/8中挑选出阳性信号较强的部分，重复步骤6）。9) 如果阳性信号丢失，则重新返回上一级，重转DH5感受态细胞中扩增，作为初级文库分库。10) 直到滤纸片被分的小到拇指指甲盖大小时，阳性质粒在分库中所占的份额增加，如果滤纸片上的菌落可以被分出单菌落，则挑单菌落扩增后提质粒，转入HEK293a细胞中观察荧光信号，这时的单菌落可能是单克隆。单克隆质粒测序后可得到目的基因。11) 如果滤纸片上的菌落不能被分出单菌落，则重新转DH5感受态细胞中扩增，涂布到10个加有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB培养基平板上，将平皿上的菌复制到滤纸上一份，同时将滤纸上的菌复制到另外的加有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB培养基平板上。注意，这次转化扩增是为了获得单菌落，所以涂布时需要摸索稀释倍数，使涂板后菌落分散。12）重新分滤纸，按照步骤4）-步骤10）获取单菌落，直到获得单菌落测序结果。六、植物细胞RT-PCRRNA提取及纯化：（材料不同，方法稍有不同） Trizol法提取植物RNA材料：1、Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇2、70-75%乙醇3、DEPC水4、RNA酶free的离心管和枪头步骤：1、 匀浆1、细胞电钻或者研磨，然后加入Trizol，混匀，室温约15 to 30C放置5 min；2、离心：12,000 g，10min，4C；3、取清澈的上清到新的支管中；4、每1 ml Trizol 加入0.2 ml氯仿，混匀。2、 相的分离5、混匀，用手活泼地震荡支管15秒，然后室温约15 to 30C放置2-3 min；6、离心：小于等于12,000 g，15min，4C；注：离心后，分为三相，下层为红色的酚和氯仿相，中间相，上层无色的水相般的是含有RNA的，体积大约有600l.3、 RNA沉淀7、移400 l上清至新管中；8、加入0.5 ml 异丙醇per 1 ml of TRIZOL；室温约15 to 30C放置10 min；9、离心：小于等于12,000 g，10min，4C；4、 RNA洗涤10、弃上清，用75% 乙醇洗涤, 每1 ml Trizol 样品至少加入1 ml 75% ethanol ，混匀，离心 小于等于7,500g，for 5 minutes at 2 to 8C；5、 RNA溶解弃上清，短暂风干air-dry RNA管5-10min，加DEPC水20-30 l溶解。注： After homogenization and before addition of chloroform, samples can be stored at -60 to -70C for at least one month. The RNA precipitate (step 4, RNA WASH) can be stored in 75% ethanol at 2 to 8C for at least one week, or at least one year at 5 to -20C. RNA纯化注意：最多 RNA 液体1.2 ml需要的材料：1、2-巯基乙醇2、 96%-100%乙醇3、离心机4、RNA酶free的离心管和枪头 1、准备裂解buffer裂解buffer中加入1% 2-巯基乙醇；2、RNA纯化步骤1、1体积的液体样品，加入1体积的上面的裂解buffer（即等体积加入），再加入等体积的96-100%乙醇；2、枪上下约吹吸5次来混匀；3、吸700 l至柱子中；4、离心，12000 g，15 秒，RT；弃废液，还放入这个的下面的收集管中；5、重复3-4步骤一次；3、DNase 消化 需准备东西：1、Resuspending PureLink DNase （溶解DNase） 粉末加入550 l RNase-free water； 短时间存4 （小于6周），长时间-20 。2、Preparing PureLink DNase（准备DNase） 准备个新的RNase-free 支管，一个样品80 l. 一个样品需要制备如下： Component Volume10X DNase I Reaction Buffer 8 lResuspended DNase (3U/l) 10 lRNase Free Water 62 lFinal Volume 80 l步骤：1、加入350 l wash buffer 1；离心，12000 g，15 秒，RT；弃废管，换新的下面的收集管；2、加入80l 上面配置的DNase 混合液；3、室温15min；4、加入350 l wash buffer 1；离心，12000 g，15 秒，RT；弃废管，换新的下面的收集管；5、加入500 l wash buffer 2；注：buffer 2 事先按说明加好乙醇；6、离心，12000 g，15 秒，RT；弃废液，还放入这个的下面的收集管中；7、重复5-6 步骤一次；8、离心，12000 g，1 min，RT；下面换新的收集RNA的小支管；9、加入30l RNase-free water，至柱子中心；10、室温放置1 min；11、离心，大于等于12000 g，1 min，RT。12、完成，即可去测浓度。普通PCR RT-PCR1. 反转录反应(将提取的RNA反转成cDNA) (注：本实验室常用Fermentas K1622试剂盒)（1）取200 l PCR管置冰上，依次加入：Total RNA1 gOligo（dt）（0.5 g/l）1 lRNase free H2Oto 12 l混匀，用微量离心机离心。 （2）置PCR仪上65 5 min变性，取出置冰上冷却。 （3）PCR管置冰上，依次加入：5reaction Buffer 4 lRNase inhibitor(20 U/l) 1 l10 mM dNTP Mix M-MuLV reverse transcriptase 2 l1 l混匀，用微量离心机离心。 注：在此步骤中，如果样品多，除反转录酶外其余可做混合加样。（4）置PCR仪上按以下条件进行：421 60 min70 5 min4 5 min（5）完成后产物cDNA即可用于PCR或置-20冰箱保存。2. PCR反应 （1）将cDNA稀释（一般5倍）作为PCR反应模板，取200 l PCR管（单个的，或者8联管）依次加入： 2PCR taq MixcDNA模板上游引物下游引物ddH2O25 l1 l1 l1 l22 ul总体积50 l用微量离心机离心，混匀。注，上述为50 l的加样体系，还可根据实验做 25 l、10 l等体系。（2）按以下条件进行PCR反应 （此步按照自己实验要求，参数可变更）： 945 min 预变性94 30 s共30-35个循环变性55-60 45 s退火72 45 s延伸7210 min最终延伸4 hold反应结束后，取PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。半定量PCRRT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。1、总RNA提取（参照RNA提取方法）2、基因组DNA的去除RNA样品中痕量的基因组DNA的去除方法参照DNase I(RNase Free)试剂说明书进行。对除去基因组DNA的总RNA样品稀释后测定OD260nm和OD280nm，计算RNA的浓度。对初提及去除基因组DNA的总RNA样品各取5 l，2琼脂糖凝胶，110 v电压，l0 min电泳后拍照。3、RT反应（步骤参看前面），将得到的cDNA溶液，保存待用。4、内参基因及目的基因的引物设计内参基因需是看家基因，目的基因要求PCR产物在350-800 bp之间较好，且退火温度和内参基因引物的退火温度保持一致。引物可以通过一些软件设计，比如primer 5，Primer3 Input等。5、PCR循环数的确定按普通 PCR循环，设定为34个循环，内参基因和目的基因分管作，内参和目的基因都做6管，在 PCR 的第18、20、22、24、36、28、30、32、34 个循环各拿出1管，一起跑电泳。选择循环次数在线性范围内，且电泳效果好的次数作为最佳循环次数。6、半定量PCR采用以上优化好的RT-PCR 条件进行PCR。实时荧光定量PCR 引物设计参照以下real-time PCR引物设计原则：红色字体代表必须遵守的，黑色字体最好遵守。1.引物不要设计在该家族的保守区内，以免引物特异性差。2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。4.G+C含量在40%60%之间，45-55最佳。5.碱基要随机分布，尽量均匀。6.引物自身不能有发夹结构，同一引物间不能有连续4个碱基的互补，避免引物内二聚体。7.引物之间不能有连续4个碱基的互补，避免引物间二聚体。8.引物5端可以修饰。9. 3端不要以A结尾，3端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。10. 引物3端要避开密码子的第3位。11.引物整体设计自由能分布5端大于3端，且3端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨内含子或者提取RNA之后有去除DNA的纯化步骤。14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70或者有8个互补碱基同源。15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。16.TM值在55-63度之间。 上样1楼技术中心实验室7500仪器下面桌子的最右上角抽屉里，有96孔板专用的架子（用PE手套包着，注意防SYBR污染）。96孔板如下图：板子有1-12列，A-H八行，在板子的右上角A12处去了一个角，便于辨认板子的上下左右。下图为96孔板示意图：123456789101112ABCDEFGH反应体系20ul体积ddH2O7ul引物2ul模板1ul（稀释五倍后的）酶10ul将96孔板正着（缺口朝向右上角）放到上样架上。注：每个模板都要有实验基因和内参基因，内参基因一般选择-actin等看家基因（引物设计要求同实验基因）；上样品的时候单上引物，模板、ddH2O和酶做一个mix，以保证模板上样量一致；每个实验都要重复三次，三次复孔最好连着在同一行。上样之后在96孔板的上表面贴膜；如下图装在3层PE手套内（防止孔板底部被磨损），包上锡箔纸（荧光染料要避光），到二楼209借用离心机，点甩30s。包上锡箔纸，放到一楼中心实验室，放到冰箱内。Realtime PCR仪器使用 使用开电源开电脑按下图中红框内按钮，打开7500仪器点击桌面上图标弹出下图对话框，点击“creat new document”进入下图界面，assay选项选择红框内“ddCt（Relative Quantation）Plate”，选择“下一步”弹出显得对话框，如下图，如果是首次添加新的基因名称请选择红框内的“new detector” 弹出新的如下图的对话框，“name”为基因名称，“reporter dye”选择“SYBR”，“color”可根据个人喜好选择，但是多个基因之间最好有区别，其他的选项不变，选择“OK”。一次类推，将所有的基因名称新建。如果基因已经输入过，可在上图中绿框内拖动滚动条寻找。新建号基因之后，选择实验基因和内参基因，点击篮框内的“add”按钮，将这些基因添加到右边紫框内。选择“下一步”。如下图上图：在下边的96孔板中选择内参的孔，勾选actin前面的“”，在task选项中选“ENDO”。下图：再在下边的96孔板中选择实验基因（OSR2为例）的孔，勾选OSR2前面的“”，在task选项中选“target”。以此类推，如下图：选择“完成”。此时，计算机将与7500仪器相连，出现下图，可以根据模板选择相应的孔，如A行的模板为”shoot”，我们就可以选择96孔板中所有的A行的孔，输入”shoot”，以此类推。结果如下图：选择红框内的“instrument”出现下图，点击红框内的按钮（加入溶解曲线），修改绿框内的样品体积为“20”，在点击黑框内的“保存”，存在D盘自己的boss的文件夹内，命名很重要不能别跟其他的所有的板子都要有区分，格式最好为“2013/6/28-plate1-OSR1-3 SHOOT-POLLEN”。如果基因的表达量比较高的话，stage 3的循环数reps是可以降到35的，但是请注意，要放在一起分析的板子要用同一个循环数，否则不能放到一起分析！保存之后关闭此软件，在D盘找到刚刚保存的程序，双击打开。点击下图红框内7500仪器的按钮打开托盘，将托盘内放入96孔板专用的架子（架子有两种，一种是8连管专用的，一种是96孔板专用的，架子上有标示，一定要注意区分！）将冰箱内的96孔板缺口朝向右上角放入架子，关闭托盘，点击上图中的“start”按钮。仪器开始自动运行。仪器运行期间请不要查看已有的sds文件，这样会造成现有的程序无响应。约2个小时20min后程序会运行结束，带着光盘（不能用U盘）将sds文件拷走进行分析。注意：引物到手之后首先需要做无模板对照，以验证是否产生引物二聚体。 结果分析首先双击结果sds文件，会自动用sds shell打开。点击红框内的运行按钮，再点绿框内的“results”，如下图选择红框内的“dissociation”;在蓝框内选择相应的基因，在黑框内选择对应的孔，图中间就会出现相应的溶解曲线，由图可见，DSR1号基因的溶解曲线只有一个峰，说明引物特异性良好。无引物二具体的证明方式为：无模板对照没有峰。上图出现了两个峰，就说明引物特异性不好，有两个PCR产物。当确定好引物没有问题了才可以进行数据分析哦下面正是进入数据分析：点击桌面上