新冠状病毒实验室检测.ppt

人冠状病毒病原学与实验室检测 谭文杰中国疾控中心病毒病所病毒病应急技术中心 20120929 冠状病毒 coronavirus 概述 1933年 Baudette等描述了鸡的 哮喘病 1937年首次从小鸡体内分离出冠状病毒 分离的病毒被鉴定为传染性支气管炎病毒 Infectiousbronchitis IBV 1951年 Gledhill等分离出鼠肝炎病毒 Murinehepatitisvirus MHV 1965年 Tyrrell和Bynoe首次在体外用人胎鼻和气管培养方法 从普通感冒病人鼻洗液中分离出一株病毒 命名为B814病毒 1966年 Hamre和Procknow用人胚肾细胞分离到类似病毒 代表株命名为229E病毒 1967年 Mclntosh等用人胚气管培养从感冒病人中分离到一批病毒 其代表株是OC43 OC代表organculture 随后证明 OC和229E病毒 1968年 JuneAlmeida和Tyrrell对这些病毒进行了形态学研究 电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突 故提出命名这类病毒为冠状病毒 1975年 国际病毒命名委员会 InternationalCommitteeontheTaxonomyofViruses ICTV 正式命名了冠状病毒科 coronaviride 致病性 人冠状病毒常引起1 普通感冒 是轻型感染 2 腹泻或胃肠炎 3 下呼吸道感染或肺炎 HCoV基因组与mRNA HCoVs为最大单股正链RNA病毒 独特的胞浆内非连续性转录模式 易于发生基因组的变异与重组 SARS CoV 中国大陆全中国全世界发病5327发病7429发病8096死亡349死亡685死亡774 涉及世界29个国家和地区 2002年冬 2003年春始发于我国广东 而后蔓延至我国大部分省市 并波及世界29个国家和地区 2003年4月16日 世界卫生组织宣布 严重急性呼吸综合症是由一种从未引起人类疾病的新型冠状病毒所致 这种新的病毒被命名为SARS Coronavirus SARS CoV SARS severeacuterespiratorysyndrome 严重急性呼吸综合征 21世纪新出现的传染病 在SARS CoV发现后 又有三种新的引起呼吸系统疾病的HCoV HCoV NL63 HCoV HKU1与HCoV 2012 被相继发现 引起人类呼吸道疾病的HCoV 包括SARS CoV 已有6种 急需研发这类疾病诊断和鉴别诊断的新技术 继SARS CoV后 新HCoV病原的发现 HCoV 2012 冠状病毒NL63vanderHoeketal 2004 Nat Med 10 368 373 最初从一名七月龄的 因发烧 细支气管炎和结膜炎入院的患儿中分离 在Hela和TMK细胞中检测到细胞毒效应CPE 随机扩增 分离出特异性片段 经测序证明是一种新的呼吸道病毒 NL63的特异性RT PCR检测儿童的NPA为阳性 回顾性的分析从2002年12月到2003年2月中测序的呼吸道样本中 有7例阳性标本 其中五个患儿是4 6月龄 两个患者 分别是40岁和67岁 冠状病毒HKU1Wooetal 2005 J Virol 79 884 895 从一名71岁的患有肺炎的老人中分离出来 该患者吸烟 并患有慢性阻塞性肺病 临床症状 发烧 咳嗽 脓性痰 胸肺X光片显示有斑点浸润 常规病毒学检测呈阴性 RT PCR确定是一种新的冠状病毒 回顾性筛选400份NPA样本 有一例是阳性 患者是一名35岁的妇女 患有肺炎 定量RT PCR 1 1x106copies mL 北京儿童医院重症下呼吸道 感染 婴幼儿呼吸道病毒的检测 2008 2010年 采集住院病人鼻咽拭子370份 应用xTAG RVPPanel试剂盒进行多种呼吸道病毒检测 样品检出阳性率 96 22 检测结果表明 感染率较高的病毒分别为 Piconavirus 54 05 RSVB 46 49 Bocavirus 33 78 PIV3 15 41 Adenovirus 12 97 HMPV 8 65 IFVA 7 03 HCoVs 6 76 xTAG RespiratoryViralPanelVersion1 RVP呼吸道病毒检测试剂盒 产品基于Luminex开放式结构平台 将xTAG 技术与xMAP 技术有效融为一体 可快速准确检测多种呼吸道病毒 已或美国FDA批准临床应用 发热呼吸道症候群病原谱构成及其流行规律 2012中东出现的新型冠状病毒 近日 一名曾前往沙特旅游的卡塔尔男子被确认感染了一种新型冠状病毒 也一度被媒体称为类似SARS病毒 目前这名男子正在英国接受治疗 生命垂危 其肺部组织提取的病毒与此前沙特曾出现的一个死亡病例相比 基因排序相似度为99 5 两人的临床表现都是急性重症呼吸道感染合并急性肾衰竭 目前在全球只确认了这两个病例 还没有证据表明该病毒能够在人与人之间进行传播 新的冠状病毒和引起非典 严重急性呼吸系统综合征 的冠状病毒不同 Fig Phylogeneticanalysisbasedon1ageneofcoronavirusesandthenewnovelcoronavirus 基于已知序列的系统发生分析 2 1 3 London1与Bat CoV HKU5序列比对 比对结果显示 London1与HKU5的相似性83 2 London1与Bat CoV HKU4序列比对 比对结果显示 London1与HKU4的相似性82 7 Examplesofbatsandbirdsfromwhichnovelcoronaviruseswerediscovered Chinesehorseshoebat Rhinolophussinicus panelA fromwhichbat SARS CoVandbat CoVHKU2werediscovered Lesserbamboobat Tylonycterispachypus panelB fromwhichbat CoVHKU4wasdiscovered Leschenault srousette Rousettuslechenaulti panelC fromwhichbat CoVHKU9wasdiscovered Amodelofcoronavirusevolution CoVsinbatsarethehypothesizedgenepoolofgroup1andgroup2CoVsandCoVsinbirdsarethehypothesizedgenepoolofgroup3CoVs 急性呼吸道感染诊断 临床诊断非特异性实验室检测X 光检测特异性实验室检测呼吸道及血清样本用来 抗原检测病毒分离核酸扩增 病毒分离 金标准抗原检测 迅速 敏感 血清学抗体检测 IgM检测 IgG检测 需要两个样本中和试验核酸检测 快速敏感 病毒诊断学 潜伏期1 12天 平均5 6天 潜伏期内无传染性 发病即有传染性若将一个传染周期定在5 6天 平均潜伏期 发病5天内能确诊病人 则可能将疫情有效控制在2代病人以内 BSL 3 1 SARS诊断分类与标准 1 疑似病例 对于缺乏明确流行病学依据 但具备其它SARS支持证据者 如临床表现和肺X线变化等 可以作为疑似病例 需进一步进行流行病学追访 并安排病原及血清学检查以求印证 对于有流行病学依据 有临床症状 但尚无肺部X线影像学变化者 也应作为疑似病例 2 临床诊断病例 对于有SARS流行病学依据 相应临床表现和肺部X线影像改变 并能排除其他疾病诊断者 可以作出SARS临床诊断 3 确定诊断 在疑似和临床诊断的基础上 若分泌物或血清SARS CoVRNA检测阳性 或血清 或血浆 SARS CoV特异性N蛋白抗原检测阳性 或血清SARS CoV抗体阳转 或抗体滴度4倍及以上增高 则可做出确定诊断 呼吸道样本 拭子或抽吸物鼻咽拭子气管 支气管深部灌洗 肺泡灌洗液样本转移液 SARS实验室检测方法一览表 SARS网络实验室检测内容与方法建议 建议对不明原因重症肺炎常规进行血清SARS CoVN蛋白检测 HCoV 2012 实验室检测 近期曾往中东地区 出现上呼吸道感染后 如果症状加重 或呼吸困难 建议立刻就诊并进行实验室检测 WHO发布了临时病例定义来帮助各国加强针对这种新病毒的健康保护措施 基于目前发现的病例 分为 正在调查中的病人 可能病例 和 确诊病例 病例的分类基于临床 流行病学和实验室检测指标 目前可进行分子检测 PCR与荧光定量PCR London1 novel CoV 2012 nsp12 partial TATTAGTGCTAAGAATAGAGCTCGCACTGTTGCAGGCGTGTCCATACTTAGCACAATGACTAATCGCCAGTACCATCAGAAAATGCTTAAGTCCATGGCTGCAACTCGTGGAGCGACTTGCGTCATTGGTACTACAAAGTTCTATGGTGGCTGGGATTTCATGCTTAAAACATTGTACAAAGATGTTGATAATCCGCATCTTATGGGT 208nt partialnucleotidesequenceoftheviralpolymerase nsp12 系统发生分析 HPA公布的结果 2012 9 25 GenBankBLAST比对结果 1 2 London1 novel CoV 2012 nsp12核苷酸序列与与SARS CoV Tor2株相应区段同源性为73 6 引物设计与应用 基于上述引物探针 我们已建立常规PCR方法 F 1 R 1 PCR片段201bp 半套式PCR方法 1stPCR F 1 R 1 nestedPCR F 1 R 2 PCR片段127bp 两种荧光定量PCR方法 F 1 R 2 TZ1 或F 2 R 2 TZ2 与其他人冠状病毒无交叉反应 可初步用于新型冠状病毒 2012 的实验室检测 引物设计与应用2 基于对London 1NovelCoronavirus已知序列与Bat CoV HKU多株序列比对 我们分别设计了两对针对HKU4和HKU5的引物及其套式引物 可分别用于Bat CoV HKU4和HKU5核酸特异性检测 核酸 基因 检测 冠状病毒检测通用引物对 Cor FW 5 ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC 3 Cor RV 5 TCRCAYTTDGGRTARTCCCA 3 冠状病毒通用引物RT PCR扩增产物电泳 One stepRT PCRassays OneStepRT PCRkit QIAGEN a50 lreactionvolumecontaining10 LRNA extract 10 l5xQIAGENOneStepRT PCRBuffer 2 ldNTPmix finalconcentrationof400 MofeachdNTP 1 8 lQIAGENOneStepRT PCREnzymeMix acombinationofOmniscriptandSensiscriptreversetranscriptaseandHot StarTaqDNApolymerase 4 Mofeachprimer andRNase freewaterto50 l Thereactionwascarriedoutwithaninitialreversetranscriptionstepat50 Cfor30min followedbyPCRactivationat95 Cfor15min 50cyclesofamplification 30secat94 C 30secat48 C 1minat72 C andafinalextensionstepat72 Cfor10min 定量PCR TaqMan体系 ABI公司首先推出 PRISM7000系列 实时检测 每个循环都会产生与PCR产物成正比的荧光物质 定量RT PCR检测 试剂盒 Real TimeOne StepRT PCRMasterMix AppliedBiosystems 25 L反应体系含 12 5 Lof2XMasterMix 0 625 Lofthe40XMultiScribeandRNaseInhibitormix 0 25 Lof10 Mprobe 0 25 Leachof50 Mforwardandreverseprimers 6 125 Lofnuclease freewater and5 Lofnucleicacidextract反应条件 30minat48 C 反转录 10minat95 C 45cyclesof15sat95 Cand1minat60 C 对照设置 HCoV阳性模板 2个阴性模板 核酸提取开始 无模板对照 PCR 扩增步骤 阳性结果判读 对照成立条件下 CT 45cycles 后续工作 代获得全基因组序列后 进行进一步分析与引物优化设计验证 研制更好的分子检测试剂表达纯化结构抗原 制备单克隆抗体 研制免疫学检测试剂结合感染病例及相关样品 确定实验室检测规