β-连环蛋白和腺瘤性结肠息肉病蛋白在小鼠牙胚发育中的表达及相互关系的研究.doc

-连环蛋白和腺瘤性结肠息肉病蛋白在小鼠牙胚发育中的表达及相互关系的研究【摘要】目的观察-连环蛋白（-catenin）和腺瘤性结肠息肉病（APC）蛋白在胎鼠下颌第一磨牙牙胚中的表达，探讨两者的作用及相互关系。方法将昆明小鼠按雌雄比21合笼，发现阴栓视为妊娠，定为E0.5 d，制作E13.5 d、E14.5 d、E15.5 d、E16.5 d、E17.5 d胎鼠下颌第一磨牙石蜡切片，免疫组化SP法检测-catenin和APC蛋白的表达与分布。结果-catenin在牙胚蕾状期、帽状期、钟状期上皮内均有表达，且随着发育的成熟，其表达逐渐增强，着色于细胞膜、质及核。APC蛋白在蕾状期牙蕾上皮呈强阳性表达，随着牙胚发育其表达逐渐减弱，着色在细胞膜、质。-catenin与APC蛋白有显著的负相关性（P0.01）。结论-catenin表达于牙胚早期细胞核及细胞质内，提示其参与了牙胚早期的细胞增殖过程。-catenin与APC蛋白的时空表达有重叠现象，并呈显著负相关，这符合WNT经典信号通路中两者的作用关系。 【关键词】 -连环蛋白； 腺瘤性结肠息肉病蛋白； 牙胚； 免疫组化Expression of β-catenin and adenomatous polyposis coli protein and correlation between them in the development of mouse tooth germ JIANG Rui-zhong, ZHU En-xin, LIU Ting-jiao. （Dept. of Stomatology,Jiaozuo Health School, Jiaozuo 454100, China; Dept. of Oral Pathology, College of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116044, China） Abstract Objective To examine the distributions of β-catenin and adenomatous polyposis coli（APC） protein in the tooth germ, and obtain the messages of function of the two factors and the relationship between them. Methods Mice were selected and cohabited with the ratio of female mice to male ones being 21, and Embryo day 0.5 was confirmed based on the finding of vaginal plug. The distributions of β-catenin and APC protein in the Embryos on day 13.5, 14.5, 15.5, 16.5, 17.5 were examined in the paraffin-embedded sections by immunohistochemistry methods. Results During E13.5 d to E17.5 d, positive expression of β-catenin was found in the oral epithelium and the dental lamina, and became more and more strong. The staining were whole cell. During the bud stage, strong positive expression of APC protein was found in the oral epithelium and the dental lamina, but the expression displayed a down-regulation tendency. The staining was the cytomembrane and cytoplasm. There was negative correlation between β-catenin and APC protein（P0.01）. Conclusion The result of β-catenin suggests its contribution in the early development of enamel organ and the proliferation of cell. Coincidance of the two factors staining site was found, according to the statistics. Key words β-catenin； adenomatous polyposis coli protein； tooth germ； immunohistochemistry 牙胚的发生是口腔牙源性上皮与间充质相互诱导的结果，在其发生过程中受到一系列信号分子的调控，如WNT、Hox及SHH家族等1-6。实验表明，WNT经典通路参与胚胎发育的许多过程，有多个因子在牙胚中表达，并越来越被大家所关注1。β-连环蛋白（β-catenin）、腺瘤性结肠息肉病（adenoma-tous polyposis coli，APC）蛋白均为WNT经典通路的重要组成因子7。APC蛋白有一个重要的功能即调节细胞内β-catenin的水平，它可与AXIN、GSK-3β等构成一个复合物，称为WNT信号的调节开关，无WNT信号传入时，该复合物可与β-catenin特定位点结合，引起游离β-catenin的降解；当有WNT信号传入时，该复合物的降解功能受抑制，β-catenin的游离水平升高，进入细胞核，将信号进行传导，从而细胞增殖8-9。近年来关于β-catenin和APC蛋白的研究多在肿瘤发生方面，牙胚发育方面的研究较少。本研究旨在利用免疫组化技术观察小鼠牙胚中β-catenin和APC蛋白的表达情况，并对二者的表达结果进行相关性分析，探讨WNT信号家族在牙胚发育中的作用。 1 材料和方法 1.1 主要试剂 β-catenin鼠抗人单克隆抗体（Santa Cruz Bio-technology inc.，美国），APC蛋白兔抗人多克隆抗体（Lab vision公司，美国），免疫组化SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，SP-9001/抗兔试剂盒，SP-9002/抗小鼠试剂盒），其余试剂由大连医科大学附属第二医院病理科提供。 1.2 标本的制取 选取由大连医科大学动物实验中心提供的性成熟昆明小鼠18只，其中雌性12只，雄性6只，晚8时按雌雄比21合笼，次日清晨8时检查雌鼠，发现阴栓视为妊娠，定为E0.5 d，分别于E13.5 d、E14.5 d、E15.5 d、E16.5 d、E17.5 d各取孕鼠2只，脊椎脱臼法处死，解剖分离胎鼠获得含磨牙的上下颌骨标本（E13.5 d、E14.5 d、E15.5 d，E16.5 d、E17.5 d的标本分别为12、11、13、13、14例）。固定、脱水、包埋后制备冠状方向4 μm连续切片，用氨丙基三乙氧基硅烷防脱液处理的载玻片捞取，60 烤箱过夜，备用。苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）常规染色，确定下颌第一磨牙牙胚发育期及位置，选接近该牙胚中部的切片进行免疫组织化学染色。 1.3 免疫组织化学染色 采用免疫组化SP法和DAB显色法，具体步骤按照说明书要求。预实验确定一抗浓度（APC蛋白为1100，β-catenin为150），抗原需枸橼酸高压热修复，用0.01 mol/L PBS缓冲液作为一抗，进行阴性对照。染色结果判定标准为：细胞（膜/质/核）出现棕黄色颗粒为阳性表达。采取半定量法计分，观察牙胚内细胞，首先按染色强弱分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分（染色深浅需与背景深浅作对比）；其次根据阳性细胞数计分：阴性为0分，小于等于10%为1分，11%50%为2分，51%75%为3分，大于75%为4分；2项计分相乘为最后结果，03分为阴性（-），35分为弱阳性（+），67分为中度阳性（+），大于等于8分为强阳性（+）10。 1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，组间均数比较采用单因素方差分析的SNK检验，P0.01为极具显著性差异，相关性分析用spearman秩相关法检验。 2 结果 2.1 HE染色观察结果 E13.5 d、E14.5 d胎鼠下颌第一磨牙牙胚为蕾状期，牙蕾上皮细胞尚未分化，呈立方状。E15.5 d、E16.5 d为帽状期，成釉器分化为3层，即内釉上皮层、星网层、外釉上皮层。内釉上皮凹面中心见原发性釉结（primary enamel knot，PEK）形成，此处细胞体积小，密集成团。E17.5 d为钟状期，成釉器分化为4层，由内向外依次为内釉上皮层、中间层、星网层和外釉上皮层，内釉上皮未来牙尖部位细胞密集，即继发性釉结（second enamel knot，SEK）形成。 2.2 免疫组化染色观察结果 2.2.1 β-catenin的表达情况 蕾状期时，口腔上皮、牙板上皮中广泛表达β-catenin，呈弱阳性；牙蕾末端上皮细胞呈中度阳性，细胞膜、质、核着色；与其相邻近的间充质细胞膜、质、核为弱阳性，外周间充质细胞呈阴性表达（图1A）。帽状期时，口腔上皮呈弱阳性表达，外釉上皮和星网层为弱阳性，内釉上皮呈阳性，PEK处为强阳性，成釉器各层细胞着色于细胞膜；近内釉上皮的牙乳头细胞的膜、质、核呈弱阳性表达；牙囊表达为阴性（图1B）。钟状期时，口腔上皮呈中度阳性表达，外釉上皮为强阳性，星网层及中间层呈弱阳性，内釉上皮呈强阳性表达，成釉器各层细胞着色于细胞膜和质；牙乳头内前成牙本质细胞的质、膜、核呈中度阳性表达；牙囊为阴性表达（图1C）。E13.5 d、E14.5 d、E15.5 d、E16.5 d、E17.5 d时β-catenin的表达结果分别为2.501.243、2.640.924、4.001.414、4.922.362、8.572.954。在蕾状期、帽状期、钟状期β-catenin表达的差异有统计学意义，且随着发育的成熟，表达逐渐增强（P0.01）。 2.2.2 APC蛋白的表达情况 蕾状期时，口腔上皮、牙板和牙蕾上皮细胞均呈强阳性，与牙蕾邻近的间充质细胞无表达，外围间充质细胞为中度阳性，着色于细胞膜、质（图2A）。帽状期时，口腔上皮为强阳性，外釉上皮为弱阳性，星网层为中度阳性，内釉上皮呈强阳性，牙乳头细胞为阴性，牙囊细胞为中度阳性表达，着色于细胞膜、质（图2B）。钟状期时，外釉上皮为阴性，星网层和中间层呈弱阳性，内釉上皮尤其基底膜处为中度阳性，牙乳头无表达，牙囊表达为弱阳性，着色于细胞膜、质（图2C）。E13.5 d、E14.5 d、E15.5 d、E16.5 d、E17.5 d时APC蛋白的表达结果分别为9.512.939、8.452.770、5.452.787、4.771.787、2.361.447。在蕾状期、帽状期、钟状期APC蛋白表达的差异有统计学意义，且随着发育的成熟，表达逐渐减弱（P0.01）。 2.2.3 β-catenin与APC蛋白的相关性分析 spearman秩相关检验结果表明，β-catenin与APC蛋白有显著的负相关性（P0.01）。 3 讨论 牙胚发生机制的研究一直受到人们的关注，它是牙齿再生医学的基础。多年来，许多学者致力于这方面的研究。Obara等11利用共聚焦激光显微镜观察小鼠帽状期成釉器中β-catenin在细胞水平的分布情况，发现釉结和内釉上皮的细胞质及核中可见β-catenin，且釉结内表达明显多于内釉上皮，在颈环和外釉上皮中只有细胞质中可见β-catenin。Obara等12还利用原位杂交的方法证实了在帽状期和钟状期的小鼠磨牙牙胚中β-catenin广泛表达，釉结、内釉上皮和正分化的中间层的表达较成釉器其他部位明显，而且在同一牙胚的内釉上皮中的表达有差异，中间层也如此，这些差异到钟状晚期即内釉上皮细胞分化为成釉细胞后逐渐消失；在牙乳头中除前成牙本质细胞中的表达有时空变化外，其他部位基本无变化，成牙本质细胞分化完成后，β-catenin表达为阴性。利用基因技术检测发现在不同时期及组织中，β-catenin的缺乏对牙发育有不同的影响，得知β-catenin在牙胚发育早期似乎必需，提示牙齿的正常发育需要β-catenin的精确表达。 本实验结果显示，β-catenin在蕾状期牙蕾末端上皮细胞呈中度阳性表达，相邻的间充质细胞为弱阳性。随着牙胚发育，其表达逐渐增强，至帽状期和钟状期，β-catenin在内釉上皮尤其是釉结处为强阳性，邻近的牙乳头细胞为弱阳性。而且在蕾状期时它位于细胞膜、质、核中，到帽状期和钟状期时主要位于细胞膜、质。本实验结果与上述研究有相似之处，从牙板形成到蕾状期结束，上皮细胞的增殖能力较强，与间充质之间的诱导也很活跃，此时β-catenin阳性表达提示可能参与了牙胚发育的启动。β-catenin有2个功能，即细胞黏附和信号传导，其在细胞膜上的表达与细胞黏附有关，在细胞质和细胞核中出现则与它介导WNT信号传导并引起细胞增殖的作用有关，因此推测β-catenin在牙胚发育过程中可能具有双重作用，既有细胞黏附作用，又有WNT信号传导作用，并且WNT经典通路作用在早期似乎更明显一些。同时还观察到β-catenin在口腔上皮、眼、舌上皮等的表达也始终呈阳性，推测其可能参与了胚胎早期多个组织的发生。 APC蛋白为WNT经典通路中另一个重要因子，本实验发现APC蛋白从蕾状期至钟状期的表达逐渐减弱，并且同一时期的表达从内釉上皮、星网层至外釉上皮逐渐减弱，推测APC蛋白的作用在牙胚早期细胞增殖活跃时较明显，主要参与牙胚早期发育，当牙胚发育到一定阶段，细胞增殖到一定程度时，其作用减弱并倾向于保持一种组织的稳定，且APC蛋白与内釉细胞的增殖分化有关。APC蛋白对细胞调控的具体机制不清，可能与自身结构变异、活性降低或受其他信号影响有关。基底膜可介导内釉上皮对前成牙本质细胞的诱导作用，又可与前成牙本质细胞表面受体结合从而控制前成牙本质细胞的分化。APC蛋白在基底膜阳性表达提示其可能与前成牙本质细胞的分化合成有关。牙囊中APC蛋白持续阳性提示它对牙囊细胞有作用。 β-catenin和APC蛋白均为WNT经典通路的重要因子。在通路中，APC蛋白为β-catenin的负性调节因子，本实验中两者表达存在显著负相关性，β-catenin的表达随牙胚发育逐渐增强，APC蛋白的表达随牙胚的发育逐渐减弱，这与WNT经典通路中两者的关系相似，这种负相关性的原因究竟是WNT信号对APC蛋白活性产生抑制引起的，还是因子自身基因编码缺失或失活或者是受到了其他信号影响的结果，有待于进一步研究。【参考文献】 1 Sarkar L, Sharpe PT. 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