微乳液多重PCR基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用.doc

微乳液多重PCR基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者：晏菱,葛芹玉单位：东南大学临床医学院，东南大学附属中大医院，江苏 南京 210009【关键词】 早孕期 Noninvasive determination of fetal gender using microarray coupled with microemulsions PCR in first trimester YAN Ling1，GE Qinyu2，JIANG Xiaoqing3，JIANG Li1（1.School of Clinical Medical Science,Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing 210009,China;2.State Key Laboratory of Bioelectronics，Southeast University，Nanjing 210096,China;3.Department of Obstetrics and Gynecology， Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029,China）Abstract：ObjectiveTo evaluate the method of microarray coupled with microemulsions polymerase chain reaction(PCR)in noninvasive determination of fetal gender in first trimester.Methods Plasma samples were obtained from 138 pregnant women at 412 weeks of gestation.Fetal DNA extracted from the plasma of pregnant women.Then six Y chromosome special sequences SRY1，SRY2，SRY3,DYS1，DYS14 and DYZ3 as the marker of fetal DNA were amplified by multiplexPCR in microemulsions，and fluorescence was labeled at the same times,β globin gene as an internal control.The labeled target DNA was hybridized and detected by the capturing DNA probes on a microarray slide，signals were scanned by ScanArray 5000 and analyzed.The results were compared to fetal gender at birth.ResultsThe earliest plasma sample which we could detect in this study was collected on the 31st day after pregnancy.The six Y chromosome sequences were detected in 76 of 78 male carrier samples, no Y chromosome sequence was detected in 60 female carrier samples.The sensitivity was 97.4% and the specificity was 100% in determination of fetal gender during the first trimester.Conclusion Microarray coupled with microemulsions PCR has excellent diagnose efficacy in determination of fetal gender.The method can be used to determine fetal sex during the first trimester，and it has potential perspective in Xlinked genetic disease screening.Key words:fetal DNA；microarray；microemulsions；multiplex polymerase chain reaction；noninvasive prenatal diagnosis(Modern Medical Journal,2007,35:8387) 性别鉴定是孕妇产前诊断的一个重要组成部分，对于性别畸形以及性连锁遗传病等的早期筛选具有重要意义。目前进行性别检测的方法主要有超声波检查、细胞学方法、分子生物学方法等。超声波检查方法只能在怀孕中期时才能准确诊断，对于早期筛选的意义不大；细胞学方法和分子生物学方法在采集样品时具有创伤性，例如羊水穿刺，这种操作可能对母儿带来危险，有的甚至造成流产1。因此以上方法不能广泛应用于临床。随着研究的深入，孕妇外周血液中胎儿DNA的发现2为胎儿的性别鉴定提供了一种新的研究材料，也为无创性产前诊断提供了可能。通过孕妇外周血中胎儿DNA的检测判定胎儿性别，可以避免传统的诊断方法带来的不足。常用的利用胎儿DNA进行胎儿性别鉴定的方法有聚合酶链反应（PCR）或巢式PCR法，由于孕妇外周血中DNA提取方法的差异及PCR易污染等固有特性，影响到其检测灵敏度和特异度。基因芯片技术自问世以来，在近几年取得了很大的进展，特别是在高通量检测方面的特性，为解决DNA检测的灵敏度和特异度的问题提供了一个新的手段。本研究采用微乳液荧光PCR技术结合基因芯片的方法，对138例早孕期孕妇外周血中的胎儿DNA Y染色体上的6个特异序列SRY1、SRY2、SRY3、DYS1、DYS14和DYZ3基因进行检测，与出生后胎儿性别进行比较，评价微乳液多重PCR基因芯片胎儿DNA检测法在早期胎儿性别判定中的意义，以期改进传统的诊断方法，避免不必要的侵入性产前诊断。1 对象与方法11 研究对象从2005年5月至2005年8月在东南大学附属中大医院妇产科进行产前检查的初孕孕妇中，随机选择138例412孕周、临床无感染征象、无其他产科合并症及并发症的孕妇作为研究对象。1.2 研究方法 1.2.1 仪器与试剂低温高速离心机、PCR仪（eppendorf公司），电子分析天平（上海精科天平仪器公司），凝胶成像系统（Syngene，Gene Genius）,PixSys5500点样仪（Cartesian Tech.Inc.）,ScanArray 5000扫描仪（Packard BioScience公司）；引物和探针由上海Boya公司合成。 1.2.2 微乳液多重PCR基因芯片法诊断胎儿性别 1.2.2.1 标本的处理及DNA的提取 所有研究对象抽取3ml外周血，EDTA抗凝。QIAampDNA试剂盒提取血浆DNA的过程按说明书进行，得到的DNA样品存放于-20备用。 1.2.2.2 微乳液多重PCR扩增 选取Y染色体上的6个特异性序列SRY1、SRY2、SRY3、DYS1、DYS14和DYZ3基因作为男性胎儿标志物，同时以βglobin基因作为阳性内对照，在微乳液中进行扩增。扩增条件为95预变性3min,9430s、5030s、 7230s 40个循环,72延伸8min后冷却至10。将扩增产物用于DNA杂交。 1.2.2.3 DNA芯片制备及DNA杂交 2ml1.5%的琼脂糖溶液均匀平铺在洁净载玻片表面，凝固后37烘干，浸泡于0.1mol•L-1 NaIO4溶液中30min,蒸馏水洗片3次，每次5min,晾干后点样，7对探针DNA序列见表1。在37，湿度为90%条件下水化1.5h，DNA芯片制备好后避光保存。在离心管中加入扩增产物和杂交缓冲液(HB)各15μl，混匀后95水浴变性6min。DNA芯片于-20预冷6min。将变性好的杂交液滴于芯片上的点样区，18mm×18mm盖玻片盖于其上，避光置于37一定湿度下杂交2h，分别用2×SSC+02% SDS液、0.1% SSC+0.2% SDS液、0.1% SSC液洗涤10min，室温晾干后扫描。 1.2.2.4 芯片扫描及结果分析 用ScanArray 5000扫描仪扫描芯片，532nm波长的激光激发Cy3荧光，得到Cy3图像文件;通过圈点确定杂交范围,过滤背景噪声,提取基因表达的荧光信号强度值,用预先定的内参照基因(βglobin基因)对Cy3的原始提取信号进行均衡和修正;用stroppro 2.0软件分析Cy3荧光信号的强度和比值。用以下3个条件作为判定基因阳性表达的标准：(1)Cy3阳性点的荧光信号平均值超过阴性点信号的3倍,ratio比值范围在2.73.3；(2)阴性荧光信表1 引物及探针序列基 号值<600，Cy3阳性荧光信号值减去阴性荧光信号值后>400；(3)PCR结果良好。当阳性内对照基因和各Y染色体基因均呈阳性时判定该样本为男性胎儿；阳性内对照基因呈阳性而其余Y染色体基因及阴性对照基因均阴性时判定该样本为女性胎儿。1.3 统计学处理计算微乳液多重PCR基因芯片法在胎儿性别诊断中的灵敏度与特异度以及约登指数，评价微乳液多重PCR基因芯片法对于早期胎儿性别的检测效力。2 结 果2.1 微乳液PCR检测效率以男性DNA为标准模板，梯度稀释后以DYS12为引物进行微乳液PCR扩增。电泳结果显示微乳液PCR的检出极限是110-8，见图1。M为分子质量标准，从上到下条带的分子质量分别为1500，1000、900、800、700、600、500、400、300、200和100bp 图1 微乳液PCR扩增的电泳结果 22 基因芯片扫描结果胎儿DNA芯片检测典型扫描结果见图2，每个样本重复检测3次。2.3 微乳液多重PCR基因芯片法检测效力分析在78份男性胎儿孕育者血样中有76份血样所有Y染色体特异序列及阳性对照基因均呈阳性，其中最早的检出样品来自怀孕 31d的孕妇；60份女性胎儿孕育者血样中没有一个Y染色体特异序列检测结果为阳性。微乳液多重PCR基因芯片法对于男性胎儿的检测灵敏度为97.4%，特异度为100%，约登指数为097，见表2。a为βglobin阳性对照基因；b、c、d、e、f、g分别为SRY1、SRY2、SRY3、DYS1、DYS14和DYZ3基因。A为芯片扫描阳性结果，即阳性内对照基因和各Y染色体基因均呈阳性时判定该样本为男性胎儿；B为芯片扫描阴性结果，即阳性内对照基因呈阳性而其余Y染色体基因均阴性时判定该样本为女性胎儿；C为未检测出所有Y染色体基因的男性胎儿孕育者血样的芯片扫描结果，即假阴性结果表2 微乳液多重PCR的基因芯片法对胎儿性别的检测效力评价微乳液多重PCR灵敏度=76/78×100%=97.4%;特异度=60/60×100%=100%；约登指数=97.4%+100%-1=0.9743 讨 论在早孕期诊断胎儿性别有利于了解胎儿患性连锁疾病的风险。目前早孕期诊断胎儿性别主要是依靠侵入性产前诊断，例如绒毛膜活检(CVS)。CVS通常在孕12周内进行，CVS造成流产的危险为0.5%1%。如果能在早孕期预先对胎儿性别进行无创性产前诊断，就能使50%的高危孕妇避免没有必要的侵入性产前诊断。1997年Lo等2发现孕妇的血浆和血清中存在游离胎儿DNA，这一发现为我们开辟了一条无创性诊断胎儿性别的道路。目前无创性诊断胎儿性别的方法有普通PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR等，主要是以Y染色体作为检测男性胎儿的标志。在早孕期，普通PCR检测的敏感度和特异度都较低，巢式PCR与传统的普通PCR相比具有快速、灵敏和特异等优点。巢式PCR在孕740周检测男性胎儿DNA的灵敏度为96%100%，特异度为88%100%35。多重PCR是基础研究和临床诊断中多基因扩增的常用手段6。然而传统的多重PCR往往不能有效地扩增出所有的DNA片段，这主要是因为多对引物延伸时相互影响,产物分析时信号相互干扰等原因,使其实际诊断位点数受限。为了克服这个问题，在本研究中我们建立了微乳液多重PCR。微乳液是水相在油相中被分散成极小液滴的具有热稳定性的体系。在本实验中我们设计在微乳液中进行多重PCR扩增，将微乳液作为多重PCR的反应中介。微乳液系统包含了分散在油相里的上百万个小液滴，这些小液滴提供了大量的微型反应器，每个反应器内都能完成一个特定的PCR反应，这样就避免了引物间以及和模板DNA相互干扰的问题。因此，多重PCR可以在微乳液体系中有效地扩增，提高了胎儿DNA检测的灵敏度。本研究电泳结果显示，男性DNA标准模板梯度稀释后微乳液PCR的检出极限是110-8。基因芯片能够高通量地平行检测胎儿DNA，在提高检测的灵敏度、特异度上有不可忽略的作用。与一次只能检测一个位点的实时荧光定量PCR相比，用本实验方法可以同时检测7个位点。由于可以在同一芯片上进行整体、平行的研究,无论在诊断速度、灵敏度还是获得总信息量上与以往检测手段相比都有很大提高。在本实验中，最早检出的男性胎儿DNA是在孕31d，这比Wataganara等7用实时荧光定量PCR检测胎儿DNA的最早检出时间还早1d。有学者报道用普通PCR进行胎儿DNA的性别鉴定8，他们的方法一次只能检测一个样品，而且在扩增完成后产物要进行电泳，很容易造成污染。我们将PCR扩增产物直接与固定在玻片上的探针杂交，由于表面固定技术和杂交冲洗技术的发展，非特异性的吸附不会对实验结果造成影响，探针的杂交检测是在一致的条件下进行的，实验结果准确可靠。用微阵列芯片的方法进行性别相关的鉴定，阳性和阴性差异明显，结果清晰可见。不容易出现假阳性的试验结果。我们采用微乳液PCR基因芯片法对138例412孕周初孕孕妇的外周血液样品进行分析，检测男性胎儿DNA的灵敏度为974%，特异度为100%，检测结果具有较高的可信性。综上所述，这种基于微乳液多重PCR和基因芯片检测孕妇外周血中男性胎儿DNA的方法具有较高的灵敏度和特异度，能够早期鉴定胎儿性别，对性连锁遗传病的筛选具有潜在的应用价值。【参考文献】1Alfirevic 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