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基因工程题库基因工程题库及答案及答案汇编汇编 一 填空题 1 基因工程是年代发展起来的遗传学的一个分支学科 基因工程技术的诞生 使人们从简单地利用现存的生物资源进行诸如发酵 酿酒 制醋和酱油等传统的生物技术时代 走向的时代 2 随着基因工程技术的诞生和发展 人类可以通过 和等三种主要生产方式 大量取得过去 只能从组织中提取的珍稀蛋白 用于研究或治病 3 Cohen 等在年构建了第一个有功能的重组DNA 分子 4 基因工程的两个基本特点是 1 2 5 基因克隆中三个基本要点是 和 6 年 美国斯坦福大学等在上发表了题为 将新的遗传信息插入SV40 病毒DNA 的生物化学方法 含有 噬菌体 基因和E coli 半乳糖操纵子的环状SV40 DNA 的论文 标志着基因工程技术的诞生 这一工作具有划时代的意义 但是他们并没有 7 克隆基因的主要目的有四 1 2 3 4 填空题答案 1 70 按人们的需要而定向地改造和创造具有新的遗传性品种 2 细菌发酵 真核细胞培养 乳腺生物反应器 3 1973 4 1 分子水平上的操作 2 细胞水平上的表达 5 克隆基因的类型 受体的选择 载体的选择 6 1972 P Berg Proc Natl Acad Sci USA 证明体外重组的 DNA 分子具有生物学功能 7 1 扩增 DNA 2 获得基因产物 3 研究基因表达调控 4 改良生物的遗传性 二 选择题 单选或多选 1 因研究重组DNA 技术而获得诺贝尔奖的科学家是 a A Komberg b W Gilbert c P Berg d B McClintock 2 第一个作为重组DNA 载体的质粒是 a pBR322 b ColEl c pSCl01 d pUCl8 3 第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是 a EcoRI b EcoB c EcoC d EcoR 4 P Berg 构建SV40 二聚体时用了几种不同的酶 其中 的作用是制造隐蔽的5 端 a 末端转移酶 b 外切核酸酶 c 外切酶 d DNA 连接酶 选择题 单选或多选 答案 1 C 2 C 3 a 4 b 三 简答题 1 为什么说基因工程技术是60 年代末70 年代初发展起来的 答 这是因为 1 1967 年发现了连接酶 2 大肠杆菌的转化技术是 1970 年获得突破 3 限制性内切核酸酶的分离始于 1970 年 4 Berg 在 1972 年构建了第一个重组的 DNA 分子 2 重组DNA 的含义是什么 答 将一个生物的 DNA 片段插入到一个载体中 并引入到另一生物体中进行繁殖 3 如何理解基因工程的两个特点 答 基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表达 分子水平的操作包括 DNA 分离 切割和连接 还有其他一些 DNA 的 修饰等 由于体外重组 DNA 的最终目的是要改变生物的遗传性 所以分子水平的操作和细胞水平的表达是基因工程的两个最基本的特点 4 在Cohen 构建有生物功能重组体的第一步实验中 用EcoRI 切割了R6 5 质粒 然后转化E coliC600 在卡那霉素抗性子板上筛选到了 pSCl02 它是由R6 5 的三个EcoRI 片段组成 请推测这个质粒具有什么遗传特性 答 至少可说明两点 1 pSC 102 含有复制起点 是一个独立的复制子 2 重组 DNA 分子中的卡那霉素抗性基因得到了表达 5 什么是动物乳腺生物反应器 答 能够分泌乳汁的转基因动物生产其他来源的基因产品 并通过乳腺分泌出来 四 问答题 1 S N Cohen 于1973 年构建了三个重组体 pSCl02 pSCl05 pSCl09 请说明这三个重组体是如何获得的 各说明了什么 答 pSCl02 用 EcoRI 切割 R6 5 混合转化大肠杆菌 在卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆 并从该克隆中分离了重组质粒 DNA 命名为 pSCl02 该质粒是由质粒 R 6 5 的 EcoRI 酶切片段 V 和 在体内连接的 说明可以利用体内连接构建重组体 pSCl05 作者分别用 EcoRI 切割质粒 pSC 101 pSC 102 然后加入 DNA 连接酶进行连接后转化大肠杆菌 在四环素和卡那霉素双抗性 的平板上筛选到 pSC 105 说明用质粒作为载体 体外连接可得到有功能的重组体 pSCl09 pSC 101 与 RSF 1010 的共整合 即用 EcoRl 分别切割这两个质粒 然后在体外进行重组 说明两个独立的复制子体外重组后 仍具有生物功能 2 基因克隆是如何使含有单个基因的 DNA 片段得到纯化的 答 大分子量的 DNA 会含有许多特殊限制性内切核酸酶的限制位点 因此用一种限制酶处理一完整染色体或整个基因组会产生许多不 同的 DNA 片段 每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段 当全部片段与用同种限制酶处理过的载体分子混合时 图 A14 1 每个片段将插入一个不同的载体分子 比如一个质粒 同样地 当用这些质粒转化宿主细胞时 每个宿主细胞将只接收一个质粒 DNA 分子而筛选出的含重组质粒的每个菌落实际上会含有某一特异的供体 DNA 片段的多个拷贝 一旦带有待研究的特定基因的克隆被确认了 此重组 DNA 分子可从宿主细胞中提取出来进行纯化 五 概念题 1 遗传工程 是遗传学和工程学相结合的一门技术科学 借用工程技术上的设计思想 在离体条件下 对生物细胞 细胞器 染色体或 DNA 分子进行按图施工的遗传操作 以求定向地改造生物的遗传性 遗传工程的概念有广义和狭义之分 2 生物技术 又称生物工艺学 生物工程学 是根据生物学 化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物 动植物细胞及其亚细 胞组分 进而利用生物体所具有的功能元件 如基因 蛋白质 等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术 它包括基因工程 细胞工程 酶工程和发酵工程等 3 基因工程 geneengineering 也称基因操作 genemanipulation 重组 DNA recombinant DNA 基因工程是以分子遗传学理论为基础 以分 子生物学和微生物学的现代方法为手段 将不同来源的基因 DNA 分子 按预先设计的蓝图 在体外构建杂种 DNA 分子 然后导人活细胞 以改变生物原有的遗传特性 获得新品种 生产新产品 或是研究基因的结构和功能 4 细胞工程 cellengineering 应用细胞生物学的原理和方法 结合工程学的技术手段 按照人们预先的设计 有计划地改变或创造细胞遗传 性的技术 以及在体外大量培养和繁殖细胞 或获得细胞产品 或利用细胞体本身的技术领域 主要内容包括细胞融合 细胞拆合 染色体 转移 基因转移 细胞或组织培养等 由于所用细胞的来源不同 细胞工程又分为微生物细胞工程 植物细胞工程 动物细胞工程等 5 细胞分泌工程 是根据细胞内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技术 主要是通过对基因改造 如基因缺失 多效分 泌突变 周质泄漏突变或拼接信号肽基因等措施 促进基因产物分泌的技术 6 酶工程 enzymeengineering 又称为酶技术 它是围绕着酶所特有的生化催化特性 结合现代化的技术手段 在体外模拟或在常温常压下 生成酶反应的产品 以及利用重组 DNA 技术定向改变酶 进行酶的修饰 或酶的全人工合成 其主要内容包括酶的化学修饰 酶的固定化 酶反应器等 7 蛋白质工程 protein engmeenng 是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作 通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特 殊功能的非天然蛋白质的技术 主要是根据蛋白质的结构和功能间的相互关系 利用基因工程技术 或用化学方法合成基因 改造基因 以 便合成新的蛋白质 或改变蛋白质的活性 功能以及溶解性等 8 发酵工程 fermentation engineering 又称微生物工程 微生物发酵工程 利用生物 主要是微生物的某种特定功能 通过现代化工程技术 手段 生产有用物质 或把微生物直接用于某种工业化生产的一种技术体系 主要内容包括菌种选育 发酵生产微生物 或植物细胞的代谢 产物 生产微生物菌体 最佳培养条件的优化组合等 9 移动基因 movable gene 又叫转座元件 订 ansposable element 是一类可以在同种 DNA 或异种 DNA 间移动的基因 但这种移动只是移动 一个拷贝 在原来的位置仍保留一份拷贝 移动基因最早是 B McClintock 夫人 1951 年在玉米中发现 她因此获得 1983 年医学和生理学诺 贝尔奖 10 断裂基因 splitgene intermptedgene 是被间隔序列间隔成若干部分 而形成不连续形式的基因 是真核基因的普遍形式 断裂基因首先在 腺病毒中发现 将断裂基因中不出现在成熟 mRNA 中的部分称为内含子 inffon 出现在成熟 mRNA 上的部分称为外显子 exon 如卵清蛋白 基因有 7 个内含子 11 重叠基因 overlapping gene 是指一个基因的序列中 含有另一基因的部分或全部序列 即一段 DNA 序列中含有合成两个或两个以上的多 肽的基因 重叠包括编码区和控制区的重叠 基因重叠现象是英国分子生物学家 Sanger 1977 年在测定噬菌体 9X174 的 DNA 序列时发现的 在噬菌体 X174 的 9 个基因中 O 基因与 A 基因重叠 而 E 基因与 D 基因重叠 12 假基因 pseudogene 是一类在基因组中稳定存在 序列组成也酷似正常基因 但不能表现出任何功能的 DNA 序列 它是相应的正常基因 突变而丧失活性的结果 从机理上推测 有可能是插入或缺失引起了移码突变或者是点突变 改变了一些剪接信号使之不能正常加工 或是 mRNA 反转录后再插入的结构 第二章第二章限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 一 填空题 1 严格地说限制性内切核酸酶 restriction endonuclease 是指已被证明是的酶 基因工程中把那些具有识别的 内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶 2 年 Luria 和 Human 在 T 偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象 3 1970 年 Smith 和 Wilcox 从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶 能够特异性的切割 DNA 这个酶后来被命名为 这是 第一个分离到的 类限制性内切核酸酶 4 通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段 可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点 相互位置的 5 类限制性内切核酸酶分子量较小 一般在 20 40kDa 通常由亚基所组成 它们的作用底物为双链 DNA 极少数 类酶也 可作用于单链 DNA 或 DNA RNA 杂合链 这类酶的专一性强 它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求 而且对更远的碱基也有要 求 因此 类酶既具有专一性 也具有专一性 一般在识别序列内切割 切割的方式有 产生 末端的 DNA 片段或的 DNA 片段 作用时需要作辅助因子 但不需要和 6 完全的回文序列具有两个基本的特点 就是 1 2 7 类限制性内切核酸酶一般识别个碱基 也有识别多序列的限制性内切核酸酶 根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析 限制 性内切核酸酶识别序列具有倾向 即它们在识别序列中含量较高 8 EcoK 是 I 类限制性内切核酸酶 分子组成是 2 2 分子量 300kDa 在这些亚基中 o 亚基具有作用 亚基具有 的活性 亚基的作用则是 9 个体之间 DNA 限制性片段长度的差异叫 10 限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的 第一个大写字母取自 第二 第三两个字母取自 第四个字母则用表示 11 限制性内切核酸酶 Acy I 识别的序列是 5 GRCGYG 3 其中 R Y 12 在酶切反应管加完各种反应物后 需要离心 2 秒钟 其目的是和 13 部分酶切可采取的措施有 1 2 3 等 14 第一个分离的限制性内切核酸酶是 而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是 15 限制性内切核酸酶 BsuRI 和 Hae 的来源不同 但识别的序列都是 它们属于 16 由于 DNA 是由 4 种碱基组成的 所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是 17 Sal I 和 Not I 都是哺乳动物中识别序列稀有的酶 在哺乳动物基因组的 5kb 片段中 找到 NotI 切点的概率是 18 部分酶切是指控制反应条件 使得酶在 DNA 序列上的识别位点只有部分得到切割 它的理论依据是 19 I 类限制酶识别 DNA 的位点和切割的 DNA 位点是不同的 切割位点的识别结合有两种模型 一种是 另一种是 20 限制性内切核酸酶通常保存在浓度的甘油溶液中 填空题答案 1 限制 修饰系统的一个组成部分 双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列 并由此切割 DNA 双链结构 2 1952 限制和修饰 3 Hind 4 限制性酶切图谱 5 2 4 个相同的 切割位点 识别位点的 平切和交错切 平 具有突出黏睦末端 Mg2 ATP SAM 6 能够在中间划一个对称轴 两侧的序列两两对称互补配对 两条互补链的 5 3 的序列组成相同 即将一条链旋转 180 则两条链重叠 7 4 6 GC 8 限制性内切核酸酶的作用 甲基化酶 识别 DNA 9 限制性片段长度多态性 RFLP 10 属名的第一个字母 种名的前两个字母 株名 11 代表 A 或者是 T 代表 G 或者 C 12 混合均匀 防止部分酶切 13 1 减少酶量 2 缩短反应时间 3 增大反应体积 14 EcoK EcoRl 15 GGCC 异源同工酶 16 4n 17 1 200 18 酶切速度是不均衡的 19 限制酶移动 DNA 弯曲 20 50 二 判断题 1 限制与修饰现象是宿主的一种保护体系 它是通过对外源 DNA 的修饰和对自身 DNA 的限制实现的 2 限制性内切核酸酶在 DNA 中的识别 切割位点的二级 三级结构也影响酶切效率 一般来说 完全切割质粒或病毒 DNA 要比切割线 状 DNA 需要更多的酶 最高的需要 20 倍 3 如果限制性内切核酸酶的识别位点位于 DNA 分子的末端 那么接近末端的程度也影响切割 如 Hpa 和 MboI 要求识别序列之前至少有 一个碱基对存在才能切割 4 能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌 其本身的基因组中没有被该核酸酶识别的序列 5 限制性图谱与限制性片段长度多态性 RFLP 图谱的最显著的区别在于前者是一个物理图谱而后者是一个连锁图 6 用限制性内切核酸酶 Hae 分别切割载体 DNA 和供体 DNA 后 可用 E coli DNA 连接酶进行连接 7 已知某一内切核酸酶在一环状 DNA 上有 3 个切点 因此 用此酶切割该环状 DNA 可得到 3 个片段 8 迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链 DNA 又能作用于单链 DNA 9 基因工程中使用的 类限制性内切核酸酶不仅有内切核酸酶的活性 而且有甲基化酶的活性 10 DNA 多态性就是限制性片段长度多态性 11 用限制性内切核酸酶 PstI 切割质粒 pBR322 后 再用外切核酸酶 Exo 进行系列缺失 可得到一系列大小不同的缺失突变体 12 甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变 是导致一些酶的星活性的主要原因之一 防止的办法是在酶切反应体系中 将甘油 的浓度控制在 5 以下 13 具有 EcoR 末端的外源片段只能以一个方向插入到 EcoR 末端的载体中 14 从 Esherichiacoli K 中分离的限制性内切核酸酶命名为 EcoK 15 同一种限制性内切核酸酶切割靶 DNA 得到的片段的两个末端都是相同的 16 在限制与修饰系统中 修饰主要是甲基化作用 一旦位点被甲基化了 其他的限制性酶就不能切割了 17 稀有酶是指那些识别序列很长又不常用的限制性内切核酸酶 判断题答案 1 错误 对外源 DNA 的限制 对自身 DNA 的修饰 2 正确 3 正确 4 错误 细菌本身基因组中核酸酶的识别序列因 C 或 A 残基的甲基化作用而受到保护 可免遭切割 5 正确 6 错误 限制性内切核酸酶 Hae 切割 DNA 产生平末端的 DNA 片段 E coliDNA 连接酶不能连接平末端 7 正确 8 错误 9 错误 类限制性内切核酸酶没有甲基化酶的活性 10 错误 DNA 多态性是指中性突变不低于 1 的一种群体 一般是不能检测的 如果这种突变发生在限制性内切核酸酶的识别位点上 就会改变酶切的模式 可以通过电泳检测出来 所以 RFLP 是 DNA 多态性的一部分 11 错误 限制性内切核酸酶 PstI 切割 DNA 后产生 3 突出的黏性末端 而外切核酸酶 Exo 只能从突出的 5 端降解 DNA 12 正确 13 正确 14 错误 应是 EcoK 15 错误 同一种限制性内切核酸酶切割靶 DNA 得到的片段的两个末端不一定相同 如果 识别序列不是完整的回文序列 产生的末端就不相同 16 错误 限制与修饰是一对保护系统 修饰了就不能被同一系统中的限制性内切核酸酶切割 但是对不同限制 修饰系统中的酶没有作用 17 错误 在某种生物基因组 DNA 中切割频率很低的酶称为稀有酶 三 选择题 单选 1 关于宿主控制的限制修饰现象的本质 下列描述中只有 不太恰当 a 由作用于同一 DNA 序列的两种酶构成 b 这一系统中的核酸酶都是 类限制性内切核酸酶 c 这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对 DNA 进行修饰 d 不同的宿主系统具有不同的限制 修饰系统 10 因研究 噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是 a J Lederberg b WArber c H Smith d FSanger 11 第一个被分离的 类酶是 a EcoK b Hind c Hind d EcoB 12 双链 DNA 中一段自我互补的序列被称为回文序列 这种序列一般具有下列特征 a 有对称轴 b 两条链的 5 3 方向的序列相同 c 是 类酶的识别序列 d 可增强基因的表达 13 在下列进行 DNA 部分酶切的条件中 控制那一项最好 a 反应时间 b 酶量 c 反应体积 d 酶反应的温度 14 在下列试剂中 那一种可以螯合 Ca 2 离子 a EDTA b 柠檬酸钠 c SDS d EGTA 15 在下列工具酶中 那一种可以被 EGTA 抑制活性 a S1 单链核酸酶 b 末端转移酶 c 碱性磷酸酶 d Bal 31 核酸酶 16 限制性内切核酸酶可以特异性地识别 a 双链 DNA 的特定碱基对 b 双链 DNA 的特定碱基序列 c 特定的三联密码 d 以上都正确 17 在下列酶中 催化反应不需要 ATP 的是 a EcoK b EcoB c T4DNA 连接酶 d BamHl 18 下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中 正确一项的是 a Sau3AI b E coRI c hindIII d Sau 3A1 19 限制性内切核酸酶的星号活性是指 a 在非常规条件下 识别和切割序列发生变化的活性 b 活性大大提高 c 切割速度大大加快 d 识别序列与原来的完全不同 20 下面哪一种不是产生星号活性的主要原因 a 甘油含量过高 b 反应体系中含有有机溶剂 c 含有非 Mg2 的二价阳离子 d 酶切反应时酶浓度过低 21 DNA 被某种酶切割后 电泳得到的电泳带有些扩散 下列原因中 那一项不太可能 a 酶失活 b 蛋白质 如 BSA 同 DNA 结合 c 酶切条件不合适 d 有外切核酸酶污染 22 关于回文序列 下列各项中 是不正确的 a 是限制性内切核酸酶的识别序列 b 是某些蛋白的识别序列 c 是基因的旁侧序列 d 是高度重复序列 23 关于宿主控制的限制修饰现象的本质 下列描述中只有 不太恰当 a 由作用于同一 DNA 序列的两种酶构成 b 这一系统中的核酸酶都是 类限制性内切核酸酶 c 这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对 DNA 进行修饰 d 不同的宿主系统具有不同的限制 修饰系统 选择题 单选或多选 答案 1 b 2 C 3 b 4 C 5 C 6 b d 7 c 8 a e 9 b c d e 10 b 11 c 12 a b c 13 b 14 d 15 d16 b 17 d 18 d 19 a 20 d 21 a 22 d 23 b 四 简答题 2 说明 SangerDNA 测序法的原理 答 SangerDNA 测序法是建立在两个基本原理之上 1 核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由 5 端向 3 端聚合 DNA 聚合酶参与了细 菌修复 DNA 合成过程 2 可延伸的引物必须能提供游离的 3 羟基末端 双脱氧核苷酸由于缺少游离的 3 羟基末端 因此会终止聚合 反应的进行 如果分别用 4 种双脱氧核苷酸终止反应 则会获得 4 组长度不同的 DNA 片段 通过比较所有 DNA 片段的长度可以得知核苷 酸的序列 3 在酶切反应缓冲液中加入 BSA 的目的是什么 机理是什么 答 目的是保护酶活性 机理是通过提高溶液中蛋白质的浓度 防止酶失活 4 Fredrick 和 McClarin 等用一个由 13 个碱基对的 DNA 片段与 EcoRI 反应 然后分离到酶和 DNA 共结晶的复合物 通过 X 射线分 析发现了什么 答 发现 具有活性的 EcoRI 是一个二聚体 它们同 DNA 结合形成一个直径为 50A的球形结构 两个 EcoRI 位于 DNA 的两侧 5 有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统 你认为噬菌体和质粒还有哪些可能的方式避免宿主的限制作用 答 某些噬菌体的基因组中有修饰的碱基 因此对限制性内切核酸酶具有免疫作用 另一种避免限制酶切割的途径是抑制 SAMase 的活性 该酶制造 S 腺苷甲硫氨酸 某些限制酶作用时需要 S 腺苷甲硫氨酸 然而 噬菌体在发育过程中不能同某些单碳的供体反应 6 某学生在用 EcoRI 切割外源 DNA 片段时 出现了星号活性 请分析可能的原因 答 盐离子浓度不对 温度不对 甘油浓度过高 7 在序列 5 CGAACATATGGAGT 3 中含有一个 6bp 的 类限制性内切核酸酶的识别序列 该位点的序列可能是什么 答 回文序列是 5 CATATG 3 8 下面几种序列中你认为哪一个 哪些 最有可能是 类酶的识别序列 GAATCG AAATTT GATATC ACGGCA 为什么 答 GATATC AAATUF 因为它们是回文序列 9 用连接酶将 Sau 3AI bGATC 切割的 DNA 与经 BamHI G GATCC 切割的 DNA 连接起来后 能够被 BamHI 切割的机率有多大 用百分 比表示 答 25 10 用 Klenow 酶填补的办法可使 5 黏性末端转变成平末端 这种方法常使 DNA 上的某些限制酶的识别位点消失 请问 对于下列限制 酶 用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失 BamH I G GATCC Taq I T CGA BssH G CGCGC 答 BssH 不会 11 请推测细菌的染色体上是否会有编码识别 8 个碱基的内切酶 怎样验证 答 关于这个问题没有明确的答案 这些酶的作用不仅仅限于噬菌体的感染 因为大多数噬菌体并不含有 8 个碱基序列的酶切位点 一种可 能是 8 个碱基的酶是质粒整合后加上去的 作为质粒附加系统的一部分 12 当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时 若要进行双酶切 应采取什么措施 为什么 答 注意星活性 先低盐 后高盐 先低温酶 后高温酶 并且可以直接在换酶前将第一种酶失活 再加第二种酶 否则 易产生星活性 或使用通用缓冲液 五 问答题 1 什么是细菌的限制 修饰系统 restriction modificationsystem R Msystem 答 细菌中有作用于同一 DNA 的两种酶 即分解 DNA 的限制酶和改变 DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶 而且 这两种酶作 用于同一 DNA 的相同部位 把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统 2 细菌的限制 修饰系统有什么意义 答 不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统 修饰的本质是通过甲基化酶将 DNA 中某些碱基进 行甲基化修饰 由于宿主自身 DNA 上的这些位点进行了修饰 限制酶就不能进行切割 由于外来的 DNA 在相应的碱基上没有被甲基化 宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我 并将人侵的外来 DNA 分子降解掉 所以 DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供了保护 3 说明限制性内切核酸酶的命名原则要点 答 限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则 即属名 种名 株名的各一个首字母 再加上序号 基本原则 3 4 个字母组成 方式是 属 名 种名 株名 序号 首字母 取属名的第一个字母 且斜体大写 第二字母 取种名的第一个字母 斜体小写 第三字母 1 取种名的第 二个字母 斜体小写 2 若种名有词头 且已命名过限制酶坝 j 取词头后的第一字母代替 第四字母 若有株名 株名则作为第四字母 是否大小写 根据原来的情况而定 但用正体 顺序号 若在同一菌株中分离了几种限制酶 则按先后顺序冠以 I 等 用正体 8 双酶消化法 doubledigests 绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理 答 双酶消化法是绘制 DNA 中两个或两个以上限制性内切核酸酶图谱所采用的方法 做法是在两个限制性内切核酸酶分别单独消化 DNA 分子的基础上 然后再用这两个酶同时或先后消化此 DNA 根据它们的结果 构建物理图谱 10 限制性片段长度多态性 restrictionfragmentlengthpolymorphism RFLP 当 DNA 序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时 或当 DNA 片段的插入 缺失或重复导致基因组 DNA 经限制性内切核酸 酶酶解后 其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时 DNA 多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析 这种多态性称为限制性片段长度 多态性 restrictionfragmentlengthpolymorphism RFLP 11 计算下列三种酶各自在某染色体 DNA 序列上识别位点间的平均距离 Alu I 5 AGCT 3 EcoR I 5 GAATTC 3 Acy I 5 GPuCGPyC 3 3 TCGA 5 3 CTTAGG 5 3 CPyGCPuG 5 12 在细菌质粒 pBPI 的四环素抗性基因 tet R的中间有一个 Hind 的切点 用 Hind 切割果蝇基因组 DNA 以 pBPl 为载体构建基因 组文库 分子杂交证明克隆 15 带有果蝇的目的基因 用 Hind 和 EcoRV 对克隆 15 进行了酶切分析 电泳结果如图 15 1 用酶切的 pBPl 质粒 DNA 作对照 旁边标出了片段的大小 1 绘制含有插入片段和不含插入片段时的 pBPl 的限制性图谱 并标明四环素抗性基因的位置 2 如果用克隆在另一个与 pBPl 完全不同源载体上的四环素抗性基因作为探针进行 Southern 印迹杂交 预测上述电泳图会出现怎样的杂交带 3 如果用克隆 15 的果蝇 DNA 片段作为探针进行 Southern 印迹杂交 放射自显影的结果又是如何 答 1 酶切图谱示于图 A15 1 图 A15 1限制性图谱 2 除 No 2 的 2 5kb No 6 的 1 5kb 和 1 0kb 没有带外 其他都有带 3 2 项中没有带的都有带 有带的都没有带 13 为什么大多数内切酶被称为 限制 酶 答 大多数内切核酸酶是限制性的内切核酸酶 只在特定的位点 即一段特定的核酸序列或甲基化核苷酸 作用 另外 限制性内切核酸酶主 要是用来切割外源片段 例如侵染的噬菌体 DNA 噬菌体对宿主具有专一性 因为在其他生物中 其 DNA 会成为细胞限制系统攻击的对象 从这种意义上说是内切核酸酶限制了噬菌体的宿主范围 14 据 Science 杂志报道 一种重要的遗传疾病可由导致 DNA 中碱基替换的诱变剂在体外进行人工诱导 设计一种快速用以鉴定疾病基因 型的检测方法 答 这要求基因座已被作图 其目的在于分离基因 测定核苷酸序列以及确定是否碱基替换突变 碱基替换突变可以改变 DNA 修饰酶 例 如甲基化酶 限制酶 的识别序列 15 为了绘制长为 3 0kb BamH 限制性片段的限制性图谱 分别用 EcoRI Hpa EcoRI Hpa 消化这一片段的三个样品 然后通过凝 胶电泳分离 DNA 片段 溴化乙锭染色后观察 DNA 带型 图 15 2 请根据这些结果 绘制一个限制性图谱 要标明 EcoRI 和 Hpa 识别 位点间的相对位置 以及它们之间的距离 kb 图 15 2用 EcoRI Hpa 单独切割及用这两种酶图 A15 23 0kb 的 BamHI 片段的限制性酶谱 混合切割 3 0kb BamH 片断产生的 DNA 带数字表示片段的大小 kb 答 图 A15 2 是 BamHI 片段的限制性图谱 倒装法绘图是同样有效的 制作这种图谱的一种方法如下 画一条适当长度的线段表示 3 0kb 的 BamHI 片段 由于 Hpa 只切割一次 Hpa 的位点可以明确地定位 从片段的任一端起 1 6kb 处标出其位置 EcoRI 切割片段两次 如 果你从片段的任一端起 1 7kb 处确定 EcoRI位点的位置 你会发现它与 Hpa 的距离同那些用双酶消化所得到片段的大小不相符 因此 1 7kb 的片段必定位于中间 两个 EcoRI 位点必定离两端各为 0 4 和 0 9kb 注 Py 二任何一种嘧啶 Pu 二任 何一种嘌吟 图 15 1酶切电泳图谱 1 2 Hind 切割 3 4 EcoRV 切割 5 6 HindIII EcoRV 1 3 5 是质粒 DNA 2 4 6 是 15 号克隆 第三章第三章DNA 和和 RNA 合成修饰酶合成修饰酶 一 填空题 1 连接酶 ligase 是一类用于核酸分子连接形成 键的核酸合成酶 有 DNA 连接酶 RNA 连接酶之分 2 原核生物主要有两种类型的 DNA 连接酶 E coliDNA 连接酶和 T4DNA 连接酶 基因工程中使用的主要是 T4DNA 连接酶 它是从 T4 噬菌体感染的 E coli 中分离的种单链多肽酶 分子量为 Oa 由 T4 噬菌体基因 编码 E coli DNA 连接是由大肠杆菌基因一编 码 也是一条多肽链的单体 分子量为kDa 这两 DNA 连接酶有两个重要的差异 第一是它们在催化反应中所用的能量来源不 同 TDNA 连接酶用 而 E coli DNA 连接酶则用作为能源 第是它们催化平末端连接的能力不同 在正常情 况下只有 T4DNA 连接酶能够连接平末端 E coliDNA 连接酶则不能 即使是调整反应条件 E coli DNA 连接酶催化平末端连接效率也只有 T4 DNA 连接酶的 3 DNA 连接酶的单位通常用 Weiss 单位表示 一个 Weiss 单位是 4 DNA 聚合酶 I 是在 1965 年从大肠杆菌细胞中分离的 所以又称为合酶 该酶由大肠杆菌基因编码 是 一种单链球蛋白 分子量为 109kDa 酶蛋白中含有一个 Zn 原子 5 T4 DNA 聚合酶与 Klenow 酶一样 具有 5 3 聚合酶和 3 5 外切酶两种性 但是它的 3 5 外切酶的活性比 Klenow 酶强 倍 该酶的 3 5 外切活性既能作用于单链 DNA 也能作用于双链 DNA 不过作用于的活性要强于链 6 反向转录酶 reverse transcriptase 是由kDa 和kDa 两个单位组成的二聚体 作用时以 RNA为模板合成 DNA 7 从小牛胸腺中分离纯化的末端转移酶催化的基本反应是将 同时释放出离的无机磷 催化反应时不需 但需 要引物 单链 DNA 是最好的引物单链 DNA 受体的长度最短需有个 dNTP 具有 3 突出末端的双链 DNA 是较好的反应底物 二价离子和 DNA 末端状态对催化反应影响较大 但是用 为辅助离子 可以催化任何形式的末端 突出的 隐含的 平齐的 加接单核苷酸 但突出的 3 端效率较高 以 Mn2 Mg 2 作为辅助因子 只能在单链 DNA 或双链 DNA3 突出端加尾 8 S1 核酸酶 S1 nuclease 是从米曲霉 Aspergillusoryzae 中分离纯化的一种含金属蛋白 分子量为 32kDa 是一种耐热的酶 37 65 9 在 S1 保护实验中 S1 切割的温度有两种 20 和 45 这是因为 在 20 时 在 45 C 时 10 技术可以用来鉴定 DNA 分子中与 DNA 结合蛋白相互作用的特定序列 11 真核生物有两种 DNA 连接酶 连接酶 I 主要是参与 而连接酶 则参与 12 T4RNA 连接酶是 1972 年发现的 并于 1977 年纯化 该酶是由 T4 噬菌体基因编码 作用是不需要模板 它在体内的作用是参与 T4 噬菌体 它不参与 DNA 合成的连接 但在中可能有作用 13 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 大片段是用切割 DNA 聚合酶 I 得到的分子量 76kDa 的大片段 具有两种酶活性 1 2 的活性 14 反向转录酶除具有以 DNA 和 RNA 为模板合成 DNA 的 5 3 合成酶的活性外 还具有 4 种酶的活性 1 2 3 4 15 RNA 连接酶作用时除了需要 ATP 和 Mg2 外 还需要 16 DNA 聚合酶 I 是一种单体酶 分子量为 109kDa 它含有金属离子 17 为了防止 DNA 的自身环化 可用 脱去双链 DNA 18 T4 单核苷酸激酶进行 DNA 片段的 5 端标记时 主要是通过两种反应即和 19 CIP 催化脱磷酸时有两种最适温度 一种是 37 适用于端脱磷酸 另一种是 56 适用于端脱磷酸 20 外切核酸酶可从双链 DNA 的 5 端依次切下 5 单核苷酸 但对不同末端的底物来说 作用效率不同 最高 最低 21 EGTA 是离子螯合剂 22 测序酶是修饰了的 T7 DNA 聚合酶 它只有酶的活性 而没有酶的活性 23 切口移位 nick translation 法标记 DNA 的基本原理在于利用的和的作用 24 欲将某一具有突出单链末端的双链 DNA 分子转变成平末端的双链形式 通常可采用或 25 反转录酶除了催化 DNA 的合成外 还具有的作用 可以将 DNA RNA 杂种双链中的水解掉 一 填空题 1 磷酸二酯 2 68 30 51 74 ATP NAD 1 100 3 在 37 下 20 分钟内催化焦磷酸交换 1nmol 32p 到 ATP 所需要的酶量 4 A Komberg Komberg polyA 5 200 单 双 6 62 94 7 脱氧单核苷酸添加到 DNA 的 3 OH 端 模板 3 C02 8 锌 9 S1 核酸酶只切割 DNA RNA 双链中的环出结构 S1 核酸酶不仅切割环出部分 也能切割与环出的相对链 10 DNA 足迹 11 DNA 的复制 DNA 的修复 12 63 尾丝的装配 tRNA 的修复 13 枯草杆菌蛋白酶 1 5 3 合成酶的活性 2 3 5 外切核酸酶 14 1 5 3 外切核酸酶活性 2 3 5 外切核酸酶活性 3 DNA 内切核酸酶的活性 Mn2 切割 SC DNA 4 解旋酶的活性 15 SH 16 Zn 17 碱性磷酸酶 5 端的磷酸基团 18 交换反应 向前反应 19 5 突出端 平末端和突出的 3 端 20 5 突出末端 3 突出末端 21 Ca2 22 5 3 合成 3 5 外切 23 DNA 聚合酶 I 5 3 外切核酸酶 5 3 合成酶 24 S1 核酸酶切割 DNA 聚合酶补平 25 核酸水解酶 H RNA 二 判断题 1 T4DNA 连接酶和 E coli 连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接 2 T4DNA 连接酶和 E coli 连接酶都能催化双链 DNA 和单链 DNA 的连接 3 反转录酶能够以单链 RNA 或单链 DNA 为模板 在引物的引发下合成一条互补的 DNA 链 以 RNA 为模板合成的 DNA 是互补 DNA complementary DNA cDNA 若是以 DNA 模板合成 DNA dNTP 的掺人速度很低 约 5 个核苷酸 秒 比 T7DNA 聚合酶的合成速 度差不多低 100 倍 4 以 RNA 为模板 用反转录酶可同时产生单链和双链的 cDNA 双链 DNA 是由自身引物引导合成 但这种自身引物引导的合成效率远 低于外加寡核苷酸引物引导的合成 5 Bal31 核酸酶 Bal31nuclease 是 Ca2 依赖性的 在反应混合物中加入 EDTA 便可抑制它的活性 6 外切核酸酶不能在双链 DNA 的 gap 和 nick 处切割 DNA 7 当一个 DNA 结合蛋白同它识别的核苷酸序列结合以后 就保护了它们的磷酸二酯键免遭切割 其结果 电泳胶上就有明显可见的空缺带 与对照相比 这就是 DNA 足迹法 8 T4DNA 连接酶和 E coli 连接酶作用时都需要 ATP 和 NAD 作为辅助因子 9 多核苷酸激酶之所以能够用于 DNA 片段的标记 是因为它能够将单个的 32P 标记的单核苷酸加到每一 DNA 链的 5 端 10 在反转录过程中 使用 AMV 比使用 M MLV 可得到较多的产物 11 真核生物可能有两种 DNA 连接酶 连接酶 I 和连接酶 都能在 DNA 合成和连接中起作用 12 DNA 聚合酶 I 有三种酶活性 其中 3 5 外切核酸酶的活性在较多的 dNTP 存在下 常被 5 3 合成酶的活性所掩盖 13 用同一种酶切割载体和外源 DNA 得到黏性末端后 为防止它们自身环化 要用 CIP 将它们脱磷酸 14 外切核酸酶的作用产物可以作为末端转移酶的作用底物 15 用外切酶 作系列缺失突变时 可以从突出的 3 端开始 16 nick 和 gap 的含义是不同的 前者指 DNA 的单链中有较小的缺失 后者仅是断开了一个磷酸二酯键 判断题答案 1 错误 E coli 连接酶不能催化平末端连接 2 错误 都不能催化单链 DNA 的连接 3 正确 4 正确 5 错误 加入 EGTA 可抑制活性 因为 EGTA 是 Ca2 螯合剂 6 正确 7 正确 8 错误 前者需要 ATP 后者需要 NAD 9 错误 将 ATP 上的 32p 加到 5 端 10 错误 使用 M MLV 反转录酶比使用 AMV 反转录酶得到较多的产物 原因是 AMV 反转录酶的 RNase H 的活性较 M MLV 反转录 酶高 所以在以 mRNA 为模板的反转录过程中 使用 AMV 反转录酶 模板被降解得快 所以得到的产物较少 11 错误 DNA 连接酶 I 主要是参与 DNA 的复制 而 DNA 连接酶 则是参与 DNA 的修复 12 正确 13 错误 载体和外源 DNA 不能同时脱磷酸 一般将载体 DNA 脱磷酸 14 正确 15 错误 不可以从突出的 3 端开始 只能从突出的 5 端开始 16 错误 正好相反 nick 是断开了一个磷酸二酯键 gap 指 DNA 的单链中有较小的缺失 三 选择题 单选或多选 1 T4DNA 连接酶是从 T4 噬菌体感染的 E coli 中分离的 这种连接酶 a 催化连接反应时既能以 ATP 又能以 NAD 作为能量来源 b 既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接 c 是一种单肽酶 分子量为 74kDa d 既能催化单链 DNA 连接又能催化双链 DNA 连接 2 DNA 连接酶在体内的主要作用是在 DNA 复制 修复中封闭缺口 a 将双链 DNA 分子中的 5 磷酸基团同 3 OH 末端重新形成磷酸二酯键 b 作用时不消耗能量 c 需要 Mn2 等二价辅助离子 d 也可以连接 RNA 分子 3 在长模板链的指导下引物延伸合成长的 DNA 互补链时应选用 a T4DNA 聚合酶 b Klenow 酶 c 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I d T7DNA 聚合酶 4 末端转移酶是合成酶类 a 作用时不需要模板 b 在 C02 的存在下 可以在突出的 3 末端延长 DNA 链 c 在 C0 2 的存在下 可以在隐蔽的 3 末端延长 DNA 链 d 上述说法有两种是正确的 5 在以下关于噬菌体 SP6RNA 聚合酶特性的描述中 是不正确的 a 能够特异性识别 SP6 启动子 b 可能在 DNA 模板的切口 nick 处停止 c 具有核酸酶活性 d 用于体外标记 RNA 探针 6 在基因工程中 可用碱性磷酸酶 a 防止 DNA 的自身环化 b 同多核苷酸激酶一起进行 DNA 的 5 末端标记 c 制备突出的 3 末端 d 上述说法都正确 7 从 E coli 中分离的连接酶 a 需要 ATP 作辅助因子 b 需要 NAD 作辅助因子 c 可以进行平末端和黏性末端连接 d 作用时不需要模板 8 下列酶中 除 外都具有磷酸酶的活性 a 核酸外切酶 b 外切酶 c 单核苷酸激酶 d 碱性磷酸酶 9 下列哪一种酶作用时需要引物 a 限制酶 b 末端转移酶 c 反转录酶 d DNA 连接酶 10 EDTA 是一种螯合剂 可以抑制大多数酶的活性 但在下列酶中 不受它的影响 a 外切酶 b EcoRI c Bal31 核酸酶 d Pst 11 S1 核酸酶的功能是 a 切割双链的 DNA b 切割单链的 RNA c 切割发夹环 d 以上有两项是正确的 12 Klenow 酶与 DNA 聚合酶相比 前者丧失了 的活性 a 5 3 合成酶 b 3 5 外切酶 c 5 3 外切酶 d 转移酶 13 用 Bal31 核酸酶作系列缺失突变时 a 缺失从一端开始 b 需要 Mg 2 作辅助因子 c 需要 Ca2 作辅助因子 d 以上有两项是正确的 14 在 cDNA 技术中 所形成的发夹环可用 a 限制性内切核酸酶切除 b 用 3 外切核酸酶切除 c 用 S1 核酸酶切除 d 用 5 外切核酸酶切除 15 外切核酸酶 a 作用时不需要模板 b 可以从 3 末端降解 DNA c 可以从 nick 部位降解 DNA d 可以从 gap 部位降解 DNA 16 T4RNA 连接酶 a 作用时不需要模板 b 作用时需要模板 c 是 1972 年发现的 d 是 1967 年发现的 17 下列 DNA 不是 外切核酸酶作用底物的是 a 具有 3 突出端的双链 DNAb 具有 5 突出端的双链 DNA c 切口 DNA d 平末端 DNA 18 可以在切口部位起作用的酶是 a S1 核酸酶 b 外切酶 c 外切核酸酶 d Bal31 核酸酶 择题 单选或多选 答案 1 b 2 a 3 d 4 C 5 C 6 a b 7 b 8 a 9 C 10 c 11 d 12 c 13 c 14 c 15 a 16 a c 17 C 18 a 四 简答题 1 按适当的顺序 列出将一种 mRNA 的 cDNA 克隆到表达载体所用到的酶 答 1 反转录酶以 mRNA 为模板复制出单链 cDNA 2 DNA 聚合酶以单链 cDNA 为模板合成双链 DNA 3 S1 核酸酶切割双链 DNA