高效液相色谱法测定巴豆中巴豆苷的含量.doc

高效液相色谱法测定巴豆中巴豆苷的含量Methods: The determination was done by using reversephase highperformance liquid chromatography with a Hedera ODS2 column (4.6 mm 250 mm, 5 m). Elution was employed with the mobile phase of acetonitrilemethanolwater (1495) at flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 292 nm and the column temperature was 25 . Injection volume was 10 L.Results: The linear range of isoguanosine was from 0.161 to 0.967 mg. The correlation coefficient of the calibration curves was 0.999 8. The average recovery rate was 98.78% with relative standard deviation of 0.02%.Conclusion: The results show that the method is simple, accurate, and repeatable, and it is suitable for quality control of Semen Crotonis Tiglii.Keywords: highperformance liquid chromatography; Semen Crotonis Tiglii; isoguanosine巴豆为大戟科植物巴豆Croton tigliun L.的干燥成熟果实，始载于神农本草经，列为下品。其性热味辛，有大毒，归胃、大肠经，泻下作用猛烈，外用于恶疮疥癣，疣痣1。现代药理研究表明巴豆主要具有致炎、致泻2，3，促肿瘤发生4，降低机体免疫功能5及抗肿瘤作用6，8。既往对其化学成分的研究主要集中于对巴豆油的分析，如有报道用气相色谱质谱联用仪采用面积归一化法确定巴豆和巴豆霜中挥发性成分的相对百分含量9。2005年版中国药典中仅有巴豆油含量测定1，未曾收载有关巴豆的毒性成分如巴豆毒素、巴豆苷、牵牛子苷的含量标准和使用限量等方面的内容，而作为一味临床较为常用的有毒中药，使用稍有不慎，极易引发中毒事件，不利于临床安全用药。同时，由于其质量控制标准的欠缺，使得医务工作者投鼠忌器，限制了巴豆药材在临床上的应用。由于巴豆中的毒性成分在某些病理状态下也是其发挥疗效的有效成分，因而更有必要对其展开研究。虽有文献报道巴豆苷、巴豆毒素的提取及药理活性研究10，11，但至今尚未有测定这些成分的方法报道。本研究采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对10批次不同产地的巴豆中巴豆苷含量进行测定，从而为有效地控制巴豆药材质量提供依据。1 材料与方法1.1 仪器与试剂 Agilent1100液相色谱仪包括四元梯度泵、自动进样器、恒温柱温箱、二极管阵列检测器(diode array detector，DAD)和Agilent Chemstation色谱工作站，美国Agilent公司生产； AG285电子天平，瑞士Mettler公司生产；KQ500E型超声波清洗器，江苏昆山超声仪器有限公司生产。乙腈、甲醇为色谱纯，实验用水为三蒸水。巴豆药材080815批次和080816、080817批次产地分别为广西、四川，购于浙江中医药大学中药饮片厂；080301批次购于河北安国市神禾中药材饮片有限责任公司，产地为四川；20081145、20081028和20080906批次购于云南向辉生物科技有限公司，产地皆为云南；081206、090205、090210批次购于山东鲁安中药饮片有限公司，产地分别为四川、云南、甘肃。以上药材均由南京中医药大学生药学教研室吴德康教授鉴定为大戟科植物巴豆Croton tigliun L.的干燥成熟果实。巴豆苷对照品(成都普思生物科技有限公司，批号为090302)用HPLC面积归一化法测定其纯度98.5%。1.2 实验方法1.2.1 色谱条件 汉邦Hedera ODS2色谱柱(4.6 mm250 mm，5 m)，流动相为乙腈甲醇水(1495)，流速为1 mL/min，检测波长292 nm，柱温25 ，进样量10 L。1.2.2 系统适应性实验 十八烷基硅烷键合硅胶(octadecylsilane chemically bonded silica，ODS)为填充剂，理论塔板数按巴豆苷峰面积计算应不低于5 000，巴豆苷与其相邻色谱峰的分离度大于1.5，色谱峰拖尾因子在0.951.05。巴豆苷的保留时间为11.8 min。空白溶液无干扰。1.2.3 对照品溶液制备 精密称取巴豆苷对照品适量，置25 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成含0.806 mg/mL的巴豆苷标准品溶液。1.2.4 供试品溶液制备 取各批次巴豆药材种仁，研碎，过二号筛。粉末置50 烘箱中干燥2 h，取出，于干燥器中放置至室温，备用。取粉末约0.3 g，精密称定，置索式提取器中，加乙醚50 mL，加热回流3 h，后弃去乙醚液。药渣挥干溶剂，连同滤纸桶移入具塞锥形瓶中，精密加入水50 mL，称定重量，超声(300 W，24 Hz)提取20 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。1.2.5 线性关系考察 精密吸取上述对照品储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，使巴豆苷浓度分别为0.016 1、0.032 2、0.048 3、0.064 4、0.080 6、0.096 7 mg/mL。将各对照品液分别进样10 L，重复2次，测定。1.2.6 重复性实验 精密吸取质量浓度为0.048 3 mg/mL的对照品溶液10 L，连续进样6次，测定，峰面积相对标准差(relative standard deviation，RSD)为0.12%。1.2.7 精密度实验 平行精密称定过二号筛的巴豆种仁粉末0.3 g，共6份。精密称定，按1.2.4中供试品制备方法处理，测定巴豆苷含量。巴豆苷的平均含量为11.7 mg/g，RSD为2.39%。1.2.8 稳定性实验 选取重复性实验样品溶液中的1份做稳定性实验，在1.2.1色谱条件下，精密吸取10 L，每隔2小时进样1次，测定18 h内巴豆苷的峰面积。巴豆苷峰面积RSD为0.50%，表明样品在18 h内稳定。1.2.9 加样回收率实验 精密称取同批干燥样品0.15 g，平行6份，置索式提取器中，加乙醚50 mL，加热回流3 h，后弃去乙醚液，药渣挥干溶剂。连同滤纸桶移入具塞锥形瓶中，分别加入对照品适量，再精密加入水50 mL，称定重量，超声(300 W，24 Hz)提取20 min，放冷。再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。进样测定。1.2.10 样品测定 分别精密称取10批次巴豆药材，每批号3份，样品处理同前，精密吸取10 L，注入液相色谱仪，测定，计算巴豆苷含量。2 结果2.1 标准曲线 按照线性关系考察方法操作，以峰面积积分值(A)对浓度(C)进行线性回归，得到回归方程：A=18 213C56.51，r0.999 8(n=6)。线性范围为0.1610.967 mg。2.2 回收率的测定 巴豆苷的平均加样回收率为98.78%，RSD为0.02%(n=6)。见表1。2.3 样品含量测定结果 10个批次巴豆药材中巴豆苷平均含量为10.216.2 mg/g。见表2和图1。表1 巴豆苷回收率(略)Table 1 Recovery rates of isoguanosine表2 样品中巴豆苷含量(略)Table 2 Determination of isoguanosine in Semen Crotonis Tiglii图1 对照品和供试品的HPLC图谱(略)Figure 1 HPLC chromatograms of reference substance and sampleA: Reference substance; B: Sample; 1: Isoguanosine.3 讨论3.1 流动相的选择 本研究对流动相的系统组成进行了比较研究，分别试用了乙腈水(1090、2 98、595)、甲醇水(595)、乙腈甲醇水(2395、3295)等系统。随着流动相中乙腈比例增加，巴豆苷保留时间缩短、峰分离度减小且峰对称性降低，当控制在2%以下时，各参数达到最佳。同时随着流动相中甲醇含量增加，巴豆苷保留时间增加、峰分离度增大，但峰对称性在4%时达到最佳。因此根据分离情况和峰型形状，认为乙腈甲醇水(1495)系统比较适宜巴豆苷的质量分析。3.2 色谱柱的选择 选用色谱柱Hypersil ODS柱(4.6 mm250 mm，5 m)、Hedera ODS2(4.6 mm250 mm，5 m)。分别采用同一体系和比例的流动相，乙腈甲醇水(1495)进行色谱分离。结果表明以色谱柱Hedera ODS2(4.6 mm250 mm，5 m)、Hypersil ODS柱(4.6 mm250 mm，5 m)分离效果均佳。3.3 提取条件的选择 巴豆苷具有较强的水溶性。预实验中对巴豆样品中巴豆苷的提取条件进行了比较，采用L9(34)正交表进行正交设计，对提取溶媒(水、20%甲醇、50%甲醇)、提取方式(超声300 W、500 W，回流)、提取时间(20、30、50 min)进行考察。结果表明，3个因素对巴豆苷含量实验结果皆无显著影响。因此从省时、节约、提取效率高、提取完全的前提出发，确定供试品溶液的最佳提取条件为取过二号筛的巴豆种仁粉末约0.3 g，精密称定，置索式提取器中，加乙醚50 mL，加热回流3 h，后弃去乙醚液，药渣挥干溶剂。连同滤纸桶移入具塞锥形瓶中，精密加入水50 mL，称定重量，超声(300 W)提取20 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。3.4