GB∕T 38421-2019 毛皮 源性成分检测 实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法

书 书 书犐 犆犛 犢 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?犌犅犜 ?（犘犆犚）?犉 狌 狉犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犪 狀 犻 犿犪 犾犱 犲 狉 犻 狏 犲 犱犿犪 狋 犲 狉 犻 犪 犾犙狌 犪 犾 犻 狋 犪 狋 犻 狏 犲狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿犲狆 狅 犾 狔犿犲 狉 犪 狊 犲犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀（犘犆犚）犿犲 狋 犺 狅 犱 狊 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由中国轻工业联合会提出。本标准由全国皮革工业标准化技术委员会（ ）归口。本标准起草单位：广州检验检测认证集团有限公司、国家皮革质量监督检验中心（浙江） 、深圳华大基因科技服务有限公司、浙江方圆检测集团股份有限公司、中国皮革制鞋研究院有限公司、陕西科技大学、中国计量大学、东莞市惟思德科技发展有限公司。本标准主要起草人：覃芳芳、黄新霞、孙海陆、陈宗良、王学川、冯爱明、张弛、孙霞、赵洋、章文福。犌犅犜 毛皮源性成分检测实时荧光定性聚合酶链式反应（犘犆犚）检测方法范围本标准规定了天然毛皮中动物源性成分定性分析的实时荧光检测方法。本标准适用于八种天然毛皮（水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊和绵羊）的源性成分定性检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 转基因产品检测实验室技术要求 动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法实时荧光方法 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光法术语和定义、缩略语 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 实时荧光聚合酶链式反应狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿犲狆 狅 犾 狔犿犲 狉 犪 狊 犲犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，实时监控整个进程，并通过扩增曲线对未知模板进行定性分析的方法。注：改写 ，定义 。 犆 狋值犮 狔 犮 犾 犲狋 犺 狉 犲 狊 犺 狅 犾 犱每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 ，定义 缩略语下列缩略语适用于本文件。：脱氧核糖核酸（ ）：二硫苏糖醇（ ） ：脱氧核苷三磷酸（ ）： 羧基荧光素（ ）：乙二胺四乙酸钠盐（ ）：聚合酶链式反应（ ）：十二烷基硫酸钠（ ）犌犅犜 ： 羧基四甲基若丹明（ ）犜犪 狇酶：聚合酶（犜犪 狇 ） ：三羟甲基氨基甲烷 （ ） ：真核生物核糖体小亚基 基因（ ）原理提取动物毛皮试样中的，针对水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊、绵羊物种特异性的内源基因序列设计引物，通过特异性引物和标记荧光物质探针，对动物源性的进行实时荧光扩增，根据扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对毛皮中动物源性成分的定性分析。试剂和材料 一般规定：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水应符合 中一级水的规定。 灭菌水。 氢氧化钠（） 。 三羟甲基氨基甲烷（ ） 。 盐酸（ ） 。 乙二胺四乙酸钠盐（） 。 十二烷基硫酸钠（） 。 氯化钠。 乙酸钠。 冰乙酸。 蛋白酶（ ） ， 条件下保存。 二硫苏糖醇（） 。 苯酚（ 平衡酚， ） 。 三氯甲烷。 异丙醇。 无水乙醇。 乙醇溶液（体积分数 ） ：取 无水乙醇（ ） ，加水定容至 。 缓冲液（ ， 和 ） ：称取 三羟甲基氨基甲烷（ ） ，溶于 水中，冷却至室温，用盐酸（ ）调节至所需值，加水定容至， 条件下高压灭菌 。 溶液（ ， ） ：称取 （ ） ，溶于 水中，用氢氧化钠（ ）调节至 ，加水定容至， 条件下高压灭菌 。 氢氧化钠溶液（ ） ：称取 氢氧化钠（ ）溶于 水中，冷却后，加水定容至 。 氯化钠溶液（ ） ：称取 氯化钠（ ）溶于 水中，加水定容至 。 裂解缓冲液：在 水中分别加入 为 的 缓冲液（ ） 、 溶液（ ） 、 氯化钠溶液（ ）和（ ） ，完全溶解后加水定容至， 条件下高压灭菌 。 乙酸钠溶液（ ， ） ：称取 乙酸钠（ ） ，溶于 水中，用冰乙酸（ ）调节至 ，加水定容至 。 缓冲液：在 水中分别加入 为 的 缓冲液（ ）和溶液（ ） ，加水定容至， 条件下高压灭菌 。 吸附柱。犌犅犜 提取试剂盒。 实时荧光试剂盒，包括犜犪 狇酶、 、体系缓冲液等，按试剂盒要求保存。 水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊和绵羊基因组，条件下保存。 引物和探针：所需引物和探针信息见表， 条件下保存。表引物和探针信息引物名称引物和探针序列（ ）目标基因内参引物探针正向反向探针（）（）真核生物 基因（内参基因）水貂引物探针正向反向探针（）（）水貂内源基因（线粒体基因）兔引物探针正向反向探针（）（ ）兔内源基因（线粒体基因）貉子引物探针正向反向探针（）（）貉子内源基因（线粒体基因）浣熊引物探针正向反向探针（）（）浣熊内源基因（线粒体基因）马引物探针正向反向探针（）（）马内源基因（线粒体基因）牛引物探针正向反向探针（）（）牛内源基因（生长激素基因）山羊引物探针正向反向探针（）（）山羊内源基因（线粒体基因）绵羊引物探针（） （）绵羊内源基因（线粒体基因）该引物和探针见 。该引物和探针见 。该引物和探针见 。该引物和探针见 。犌犅犜 仪器与设备 分析天平，精度为 。 计，精度为 。 高压灭菌锅。 剪刀。 恒温水浴箱。 涡旋振荡器。 高速冷冻离心机。 微量可调移液器： 、 、 、 、 。 超微量核酸蛋白分析仪。 超净工作台。 实时荧光热循环仪（发射波长： 、 、 、 、 、 ；单位：） 。试验步骤 犇犖犃提取 试样犇犖犃提取将试样去毛后剪碎（小于） ，称取试样，放入 离心管中，加入预热至 氢氧化钠溶液（ ） ，混匀（混匀时间不宜超过 ） ，立即加入 灭菌水（ ） 。 离心 ，倾去上层液体。加入 灭菌水（ ） ，混匀后 离心 ，倾去上层液体。浅色试样重复本操作次次，深色样品重复本操作次次。加入 裂解缓冲液（ ） ，混匀后用冰乙酸（ ）或乙酸钠溶液（ ）调节为 ，加入 蛋白酶（ ）和 （ ） ， 恒温水浴（或 恒温水浴 ） ，期间振荡混匀次次。取出，室温放置 ， 离心 。取上清液，加入等体积苯酚（ ） ，振荡混匀 ， 离心 ，然后取上清液重复操作一次。取上清液，加入等体积三氯甲烷（ ） ，振荡混匀 ， 离心 ，然后取上清液重复操作一次。取上清液，加入等体积异丙醇（ ） ，混匀后冰上静置以上。将混合液转入吸附柱（ ） ，室温放置 ， 离心 ，倾去液体。加入 乙醇溶液（ ） ， 离心 。倾去液体后重复操作一次。 继续离心 加快乙醇挥发，然后将吸附柱放入新的 离心管中，室温放置 ，使乙醇挥发完全。加入 缓冲液（ ） ，室温静置 ， 离心 ，取上清液，即为试样溶液，待测。注：除上述方法外，也可用等效的提取方法提取试样。犌犅犜 阴性对照模板犇犖犃提取以滤纸代替试样，按 的方法提取溶液，作为扩增的阴性对照。 犇犖犃质量评估用超微量核酸蛋白分析仪（ ）对试样的质量进行评估，分别检测 、 和 波长处的吸光值 、 和 ，若同时满足以下要求则适宜扩增： 浓度 ； ； 。若按照 的方法提取的试样不能满足以上要求时，应将进一步纯化。注：可根据试样的具体情况选择苯酚三氯甲烷抽提、纯化柱等方式进行纯化。 实时荧光犘犆犚检测 内参基因检测可先将试样进行内参基因的实时荧光检测，若检测结果为阳性，表明提取的试样适宜进行检测，可以进行动物内源基因的检测；若检测结果为阴性，表明提取的不适宜进行检测，应重新提取。若重新检测结果仍为阴性，则本方法不适用于该试样检测。 实时荧光犘犆犚扩增体系为确保检测结果的准确性，在进行试样检测时，应同时设立空白对照、阴性对照和阳性对照试验。在超净工作台（ ）中按表配制实时荧光扩增体系，每个试样的平行扩增次。表实时荧光犘犆犚扩增体系试剂名称体积 缓冲液 （ ） 引物（ ）正向： 反向： 探针（ ） 犜犪 狇酶（） （）模板（ ）灭菌水补足总体积至 注：空白对照试验时，用灭菌水（ ）代替试样。注：阴性对照试验时，用模板（ ）代替试样。注：阳性对照试验时，用水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊和绵羊基因组（ ） 。犌犅犜 实时荧光犘犆犚扩增循环参数混匀离心后置于实时荧光仪上进行扩增，扩增参数根据不同仪器有所不同。一般反应参数为： 预变性 后，按 ， ， 个循环，最后于结束反应。 平行试验每个试样应至少平行试验次。结果分析 质量控制 实时荧光犘犆犚有效性判定空白对照：无荧光信号，相应 值 。阴性对照：无荧光信号，相应 值 。阳性对照：有荧光信号，且通道出现明显的扩增曲线， 值 。否则判定为无效。 犇犖犃提取有效性判定取内参照引物对试样提取液进行扩增，在符合 的情况下，被检测试样应有荧光信号检出，且通道出现明显的扩增曲线， 值 。否则提取无效，应重新提取，直至 值 。 动物内源基因的检测结果判定在符合 的情况下，对试样提取液进行各动物内源基因的实时荧光扩增检测：如有荧光检出，且 值 ，则判断该试样检出该动物源性成分。如 值 ，则判断该试样未检出该动物源性成分。如 值 ，则需重复试验。再次扩增后 值 ，且阳性对照、阴性对照和空白对照正常，则判断该试样检出该动物源性成分；再次扩增后， 值 ，且阳性对照、阴性对照和空白对照正常，则判断该试样未检出该动物源性成分。结果表述试样内参基因的检测结果为阴性，则表述为“该试样不适用于本方法检测” 。试样内参基因的检测结果为阳性且某种动物（如水貂）内源基因